響應面法優化柞水天麻產地加工工藝*

武 旭，吳亞楠，閆海英，張麗娟

（1.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046；2.空軍第九八六醫院第五門診部，陜西 西安 710061；3.潼關縣人民醫院，陜西 渭南 714300）

天麻（Gastrodiae Rhizoma）為蘭科植物天麻Gastrodia elata BI.的干燥塊莖，立冬后至次年清明前采挖，洗凈蒸透敞開低溫干燥。天麻具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通絡等功效，臨床上常用于治療癲癇抽搐、頭痛眩暈、手足不遂、肢體麻木、風濕痹痛、小兒驚風、破傷風等[1]。天麻中含有酚類、甾醇類、有機酸類、多糖類等化合物[2-3]。天麻具有鎮靜安神、抗抑郁、抗焦慮、抗氧化、抗病毒和抗腫瘤等多種藥理學活性[4]。柞水天麻產地加工方法一般進行蒸或煮30 min，直至手捏會發軟，對光照看時見到半透明無實心，取出用木板壓扁后充分干燥；或新鮮天麻直接切4 mm厚片后烘至半干，壓平后充分干燥；云南省尚有天麻凍干片，為新鮮天麻切厚片后冷凍干燥的處理方法。但鮮切天麻片受中藥飲片產地鮮切合法性影響，僅部分省份如湖北省開展了鮮切天麻片的炮制規范公示，中華人民共和國衛生健康委員會和國家市場監督管理總局僅將天麻作為藥食同源試點品種，還尚未納入藥食同源目錄進行管理。此類鮮切片多作為保健食品，其藥品屬性還需結合各省的法規規定。蒸煮的目的即起到“殺酶保苷”的作用，同時便于塊莖類藥材迅速干燥不至霉變[5-6]。天麻為異養型的藥用植物，它的種植栽培在農業和醫藥業發展中起著重要的作用，不同的產地加工和干燥方法都會影響藥材的質量。筆者采用響應面法優化柞水天麻的干燥工藝，以天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E、總多糖和浸出物含量為考察指標，優化天麻藥材產地加工工藝，為發展天麻產業，以期保證藥源提供可靠方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 LC-2030 Plus島津高效液相色譜儀（日本島津公司，配置LC-2030 UV檢測器）；NewCLassic MS-S電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；XM-P102H無極調功超聲波清洗機（昆山超聲儀器有限公司）；0.22 μm微孔濾膜（天津杉羽科技有限公司）；HH-2電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）；101型電熱鼓風干燥機（上?？坪銓崢I發展有限公司）；L5型紫外-可見分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）；UPL-10L超純水機（四川卓越水處理有限公司）。

1.2 試藥 天麻素（批號：T10M9F55562，純度≥98.0%）、對羥基苯甲醇（批號：H21D6Q7813，純度≥98.0%）均購自上海源葉生物科技有限公司；巴利森苷A（批號：PS011129，純度≥98.0%）、巴利森苷B（批號：PS011138，純度≥98.0%）、巴利森苷C（批號：PS011140，純度≥99.0%）、巴利森苷E（批號：PS012053，純度≥99.0%）均購自成都普思生物科技股份有限公司。乙腈為色譜純，無水乙醇、苯酚、硫酸等其他試劑均為分析純。新鮮天麻藥材由柞水縣世紀生態農業有限公司提供，經陜西中醫藥大學藥學院王昌利教授鑒定為蘭科植物天麻Gastrodia elata BI.的干燥塊莖。

2 方法與結果

2.1 天麻藥材的加工 2020年版《中華人民共和國藥典》規定將新鮮天麻凈制后，蒸制透心低溫干燥即得。柞水產地通常將天麻蒸透后用木板壓扁，白天日曬，夜晚炕烘一周即可。也有文獻報道將天麻藥材置于55 ℃電熱恒溫鼓風干燥箱中干燥，至藥材含水量在15%以下（期間取出發汗2次）[7]。綜合考慮暫定新鮮天麻產地加工工藝為蒸透后55 ℃干燥5 d。

2.2 天麻藥材含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適用性條件 色譜柱為Agilent5 TC-（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動相；按照0～10 min，3%A～10%A；10～15 min，10%A～12%A；15～25 min，12%A～18%A；25～40 min，18%A；40～42 min，18%A～95%A，梯度洗脫。流速：0.8 mL/min，檢測波長：220 nm，柱溫：40 ℃，進樣量：10 μL。理論塔板數按照各個目標峰計算應不低于7 000，分離度不得低于1.6。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取各對照品，用甲醇:水（3∶97）溶液配制成含對羥基苯甲醇（0.079 mg/mL）、天麻素（1.560 mg/mL）、巴利森苷A（0.412 mg/mL）、巴利森苷B（0.347mg/mL）、巴利森苷C（0.371mg/mL）、巴利森苷E（0.145mg/mL）的混合對照品溶液。色譜圖見圖1A。

2.2.3 供試品溶液的制備 取供試品粉末（過三號篩）約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，振搖2 h后稱定質量，加熱回流3 h，放冷稱定，用乙醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液10 mL，蒸干，殘渣用甲醇-水（3∶97）溶解，定容至25 mL量瓶中，搖勻，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得，色譜圖見圖1B。

圖1 HPLC 色譜圖

2.2.4 線性關系考察 精密量取“2.2.2”項下的混合對照品溶液2、8、12、16、20、24 μL，按照“2.2.1”項下的色譜條件進行測定，以進樣濃度（mg/mL）為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），分別繪制標準曲線。各對照品的線性關系考察結果見表1，可知各成分在線性范圍內均呈現出良好的線性關系。

表1 天麻混合對照品標準曲線

2.2.5 精密度試驗 將混合對照品溶液重復進樣6次，記錄各成分對應波長下的峰面積和保留時間。天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E混標的RSD值分別為0.13%、0.12%、0.32%、0.63%、0.41%、0.21%，表明儀器的精密度良好。

2.2.6 穩定性試驗 同一天麻藥材樣品分別在0、2、4、6、8、10、12 h進樣，記錄峰面積。測得天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E含量的RSD值分別為1.24%、1.41%、1.03%、1.22%、1.47%、2.01%，表明該方法12 h內穩定性良好。

2.2.7 重復性試驗 取6份天麻藥材照“2.2.3”項下方法制備樣品，按照“2.2.1”項下上述色譜條件，測定峰面積并計算含量。結果天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E含量的RSD值分別為1.27%、1.35%、1.43%、1.72%、1.57%、2.33%，表明該方法的重復性較好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的1 g天麻藥材6份加適量天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E對照品，照“2.2.3”項下方法制備樣品，進樣，記錄峰面積。天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E的平均回收率和RSD值見表2，結果表明該方法回收率良好。

表2 加樣回收率試驗結果（n=6）

2.3 天麻總多糖含量的測定

2.3.1 葡萄糖對照品溶液的制備 精密稱取恒重后的無水葡萄糖對照品5.015 g，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得50.15 mg/mL的葡萄糖對照品溶液[8]。

2.3.2 供試品溶液的制備 稱取供試品粉末約0.5 g，精密稱定，加95%乙醇100 mL回流提取1 h，趁熱過濾，殘渣用95%乙醇洗滌3次，每次10 mL，將殘渣及濾紙加蒸餾水100 mL，回流提取2 h，趁熱過濾，用熱水將殘渣及提取容器洗滌3次，每次10 mL，洗液與濾液合并，移入250 mL容量瓶中，稀釋至刻度，即得[9]。

2.3.3 線性關系考察 精密量取對照品溶液0、20、40、60、80、100 μL，分別置于10 mL試管中，分別加入蒸餾水使其總體積達到1.0 mL，搖勻，分別加入5%苯酚溶液1.5 mL，搖勻，迅速滴入濃硫酸5.0 mL，搖勻。靜置10 min，水浴加熱15 min，取出放冷，以0 μL的溶液作為空白對照，用苯酚-硫酸法在490 nm波長下檢測樣品吸光度值。以吸光度為縱坐標，質量濃度為縱坐標繪制標準曲線。葡萄糖線性回歸方程為A=1.830 9C+0.032 4，R2＝0.992 6，說明葡萄糖質量濃度在0～0.668 6 mg/mL范圍內與紫外吸光度值呈良好的線性關系。

2.3.4 精密度試驗 將葡萄糖對照品溶液重復進樣6次，記錄吸光度，經計算RSD值為1.8%，表明儀器有良好的精密度。

2.3.5 穩定性試驗 同一天麻藥材樣品分別在0、2、4、6、8 h測的吸光度，經計算RSD值為1.0%，結果表明供試品溶液在8 h內穩定。

2.3.6 重復性試驗 取6份天麻藥材照“2.3.2”項下方法制備樣品進樣測得吸光度，計算RSD值為2.60%，表明實驗方法有良好的重復性。

2.3.7 加樣回收率試驗 精密稱取6份已知含量的天麻藥供試品溶液0.5 mL，分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL葡萄糖對照品，照“2.3.2”項下方法制備樣品進樣計算平均加樣回收率及RSD值。天麻藥材總多糖的平均回收率和RSD值見表3，結果表明該方法加樣回收率良好。

表3 加樣回收率試驗結果（n=6）

2.4 醇溶性浸出物的測定 參照2020年版《中華人民共和國藥典》四部醇溶性浸出物測定法（通則2201)項下的冷浸法[9]測定。

2.5 單因素試驗

2.5.1 蒸制時間考察 稱取新鮮天麻藥材常壓蒸制，于蒸鍋圓汽后分別在10、20、30、40、50、60 min時間節點取天麻藥材。結合對光照看透心和切開看透心的方法判斷是否蒸透。天麻鮮藥材蒸制20 min時中心仍有硬心，30 min即可達到透心的結果，因此確定30 min為新鮮天麻蒸制透心時間。

2.5.2 干燥溫度考察 稱取新鮮天麻藥材5份，常壓蒸制30 min，分別在35 ℃、45 ℃、55 ℃、65 ℃、75 ℃條件下干燥5 d，測定各樣品中天麻素等6種成分，醇溶性浸出物和總多糖的含量，計算總評歸一值[根據，總評歸一值OD=（d1+d2+d3…+dk）/k，其中Ymin為指標中最小值，Ymax為指標中最大值，k為指標數][10]，同時根據水分測定結果選擇合適的干燥溫度。實驗結果表明，天麻干燥溫度過高導致有效成分劇烈降低，也符合藥典規定的低溫干燥的要求，結合水分測定結果可知35 ℃時天麻藥材干燥5 d未達到《中華人民共和國藥典》規定水分要求（17.6），55 ℃時水分達標且含量測定OD值也最優，后續以45℃、55 ℃和65 ℃進一步考察最佳干燥溫度。

2.5.3 干燥時間考察 稱取新鮮天麻5份，常壓蒸制30 min，在55 ℃條件下干燥3、4、5、6、7 d。測定各樣品中天麻素等6種成分，醇溶性浸出物和總多糖的含量，計算OD值，同時根據水分測定結果選擇合適的干燥溫度。實驗結果表明蒸透心天麻55 ℃干燥4 d后水分即可達標，干燥時間越長含量越高，在第6天的時候基本穩定，后續以5、6、7 d進一步考察最佳干燥溫度。

圖2 干燥溫度及干燥時間的單因素考察結果圖

2.6 響應面法優化天麻加工工藝 采用Design-Expert 11軟件設計中心復合法試驗，結合單因素實驗結果，選取天麻干燥溫度（A）和干燥時間（B）作為2個考察因素，每個因素3個水平，見表4。以天麻素、對羥基苯甲醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E、總多糖和醇溶性浸出物含量總評歸一值（OD值）為評價指標，而對實驗中選取的2個因素進行考察和優化。

表4 中心設計響應面法因素水平表

對中心設計實驗結果運用Design-Expert軟件進行響應面分析，結果見表5～6，以天麻含量總評OD值為響應值，對干燥溫度和干燥時間多元線性回歸二項式方程擬合，擬合的方程模型：OD=0.915-0.2A-0.003 8B-0.589 04A2-0.168 0B2，擬合得到的回歸方程P＜0.01，差異有統計學意義。干燥時間和干燥溫度對OD值的影響顯著（P＜0.05）。實驗模型較為顯著（P＜0.01），決定系數R2=0.979 1體現出該模型與實驗數據擬合程度較高，可應用于天麻含量總評值的預測。OD值與干燥溫度和干燥時間的三維效應面曲線見圖3。以OD值最大值為目標，根據Design Expert 12實驗設計軟件得最佳天麻加工最優工藝參數為干燥溫度為47.77 ℃，干燥時間為7 d，天麻藥材含量預測最大值為0.975。

圖3 干燥溫度及干燥時間的交互作用響應面圖

表5 響應面實驗設計結果

表6 方差分析表

2.7 天麻產地加工工藝驗證 由Expert-design 11.0軟件CCD試驗設計，預測到天麻最佳干燥工藝為蒸制30 min透心后，在47.77 ℃下干燥7 d。結合實際操作情況，將天麻的干燥溫度確定為50 ℃。該條件下制備3批天麻藥材，測定結果見表7，平均OD值為0.979 8，接近且優于預測OD值0.975，證明回歸模型預測準確可靠，所優化出的天麻產地加工工藝具有較好的重復性和操作性。

表7 實驗驗證結果（n=3）

圖4 天麻藥材圖

3 討論

天麻為常用的名貴中藥之一，始載于《神農本草經》，天麻在《神農本草經》中被列為上品，且《本草綱目》《開寶本草》等諸多中醫藥古籍中均有天麻的記載。天麻素為其主要的有效成分，具有良好的鎮痛作用，臨床上多用于治療頭痛、眩暈、神經痛、冠心病、心絞痛等[8-9]。在現代應用中為了防止天麻素的分解和酚類成分酶促反應，天麻在干燥之前必須進行“斷生”以達到“殺酶保苷”的作用，但天麻素和自身的多糖等成分極易溶于水，故在天麻炮制加工過程中往往采用蒸制法而非煮制。

2020年版《中華人民共和國藥典》以天麻素，對羥基苯甲醇，巴利森苷A、B、C、E 6種成分的色譜圖，作為特征圖譜。同時，巴利森苷A、B、C、E在藥材及飲片中含量較高，是天麻中主要的入血成分[11-12]。故本實驗以6種特征成分和總多糖及醇溶性浸出物含量作為考察指標，結合響應面法設計實驗對天麻藥材的干燥工藝進行優化。響應面設計能夠對實驗中的每個水平進行連續分析從而得到直觀的結果[13-14]。本實驗以天麻的蒸制時間、干燥溫度、干燥時間作為3個考察因素，并以各個考察指標的OD值進行評價。其中干燥溫度對天麻品質影響較大，高溫干燥處理會導致天麻素類成分急劇下降，因此天麻在加工時應盡量保持較低溫度，又要考慮干燥效率避免霉變。筆者應用響應面法分析優選出天麻藥材的最佳干燥工藝為蒸制時間30 min，干燥溫度50 ℃，干燥時間7 d，為天麻藥材的干燥加工提供了可靠依據。