海風藤醇提取物對慢性硬膜下血腫大鼠血管新生的作用及對VEGF、bFGF表達的影響*

夏士濤，王培宇，張開創，魏 靜

（黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040）

慢性硬膜下血腫（chronic subdural hematomas，CSDH）常見于老年群體。隨著老齡化社會結構的發展，接受介入手術的老年患者日益增加，抗凝藥物、抗血小板藥物的廣泛應用導致CSDH發病率逐年上升[1]。近年來研究發現[2-3]，CSDH血腫吸收速度與血腫包膜血管新生具有緊密聯系，而血管內皮細胞生長因子（vascularendoth elial growth factor，VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）等血管生成相關因子與該病預后同樣密切相關。海風藤是胡椒科植物風藤Piper kadsura（Choisy）Ohwi的干燥藤莖，具有通經絡、祛風濕的功效，主要用于風寒濕痹、筋脈拘攣、屈伸不利的治療。有報道顯示[4]，海風藤提取物可通過減輕氧化應激、減少神經元凋亡改善腦缺血再灌注損傷大鼠腦損傷，提示其具有神經功能保護作用。但目前有關海風藤醇提取物對CSDH治療作用的研究尚少。本研究通過建立CSDH大鼠模型，觀察海風藤醇提取物對血管新生及VEGF、bFGF表達的影響，以期為其臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 12周齡SPF級雄性Wistar大鼠60只，體質量（370±20）g，購自北京百奧賽圖基因生物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2020-0007。所有大鼠健康狀態良好，實驗前于動物房適應性飼養7 d，溫度（24±1）℃，相對濕度（55±5）%，12 h/12 h明暗交替。本研究經實驗動物管理委員會批準。

1.2 藥物與試劑 海風藤醇提取物（批號：1073-06-9，純度＞98%）購自西安青芷生物技術有限公司，使用前與DMSO混合，配制成質量濃度為1、5、10 μg/mL的溶液；免疫組織化學染色試劑盒（上海邦景實業有限公司，批號：BJ-15041）；HE染色試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，批號：ZN1970）；兔抗大鼠CD31一抗（批號：ab28364）、兔抗大鼠VEGF一抗（批號：ab32152）、兔抗大鼠bFGF一抗（批號：ab208687）均購自美國Abcam公司。

1.3 主要儀器 ALC-H型大鼠電動腦立體定向儀（上海奧爾科特生物科技有限公司）；微量注射泵（淮北軟隆生物科技有限公司）；MacroMR型小動物核磁共振（magnetic resonance imaging，MRI）成像儀（蘇州紐邁分析儀器股份有限公司）；H7500型電子顯微鏡（日本株式會社日立制作所）；iBright Imager型凝膠成像分析系統（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.4 造模與分組[5]大鼠適應性喂養7 d后開始建模。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠，以立體定向儀固定于操作臺，頭頂部正中垂直切口，長度5 mm，采用楔形高速鉆頭在矢狀縫及冠狀縫左側3 mm位置鉆一個直徑為0.9 mm的骨窗。顯微鏡下采用1 mL空針針尖將尚未完全磨開的硬腦膜分離。采用無菌注射器采集大鼠尾靜脈靜脈血600 μL，調整立體定向儀使注射器前端錐形開口在下降時可恰好嵌頓于骨窗，啟動微量注射泵，以30 μL/min的速度緩慢向硬膜下隙注射非抗凝自體血液300 μL，全部注入硬膜下腔后，調整速度為10 μL/min注射10 min，防止迅速注血引發顱內壓急劇升高或急性腦損傷，兩個階段注血共計400 μL。血凝后將注血針拔除，縫合切口，常規消毒。建模成功標準：建模后3、10、17、24 d采用3.0 T MRI掃描檢測大鼠頭部，如首次注血后第3天急性期血腫在T2WI序列圖像上呈現為位于額頂顳葉及硬腦膜之間的橢圓形高信號影像，且后續掃描無嚴重挫裂傷、血腫突破、重度腦水腫表示建模成功。10只大鼠僅開骨窗、縫合，作為假手術組。50只大鼠建立CSDH模型，3只死亡，40只建模成功，將建模成功大鼠隨機分為模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，每組10只。

1.5 實驗給藥 建模后24 d確認建模成功后開始給藥。低、中、高劑量組大鼠分別按照1 mL/100 g腹腔注射質量濃度為1、5、10 μg/mL的海風藤醇提取物DMSO溶液，假手術組、模型組大鼠均按照1mL/100 g腹腔注射DMSO溶液。1次/d，連續給藥14d。

1.6 觀察指標

1.6.1 硬膜下血腫體積 末次給藥后次日，采用3.0 T MRI掃描檢測各組大鼠頭部，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，將其置于MRI掃描專用線圈中，設置為T2WI序列進行冠狀位掃描，層厚：1 mm。選取血腫體積最大斷層截面，測量血腫縱徑、橫徑，記錄血腫層面，計算血腫體積。

1.6.2 大鼠神經功能評價 末次給藥后次日，采用Zea Longa評分法評價大鼠神經功能[6]。0分：無神經功能缺損；1分：對側前爪不能完全伸張；2分：向對側轉圈行走；3分：向對側行走傾倒；4分：意識模糊，難以站立爬行。分數越高，提示大鼠神經功能損傷越嚴重。

1.6.3 組織取材 MRI掃描及大鼠神經功能評價完成后，脫頸處死大鼠，剝離大鼠血腫外膜，分為兩份，一份用4%多聚甲醛固定，病理切片機切成4 μm厚度切片，用于免疫組化染色及HE染色，一份保存于液氮中用于Western blotting檢測。

1.6.4 硬膜新生血管密度 取硬膜組織切片，脫蠟后PBS沖洗，3%過氧化氫孵育15 min，PBS浸泡30 min。滴加枸櫞酸鹽抗原修復液，微波后冷卻至40 ℃，蒸餾水沖洗。滴加山羊血清室溫下封閉15 min，棄血清。滴加兔抗大鼠CD31一抗（1∶800），濕盒中4 ℃過夜，PBS沖洗。山羊抗兔IgG二抗（1∶2 000），37 ℃孵育15 min，PBS沖洗。DAB顯色，自來水沖洗，蘇木精復染，常規脫水，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察，隨機選取5個不相鄰視野，計算新生血管密度。

1.6.5 硬膜組織病理變化 取硬膜組織切片常規脫蠟，沖洗1 min，蘇木精染液染色5 min，沖洗，滴入1%鹽酸酒精，沖洗2 s，促藍液反藍，沖洗15 s，1%伊紅染液染色30 s，自來水沖洗，使用梯度乙醇脫水，二甲苯透明2次，每次3 s，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察病理變化。

1.6.6 硬膜組織中VEGF、bFGF蛋白表達水平 取液氮保存的硬膜組織，RIPA裂解液裂解，BCA試劑盒定量蛋白濃度。取30 μg待測樣本上樣，沸水浴5 min，離心取上清，恒壓下經10%SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳后濕轉至膜，室溫下封閉液封閉2 h，加入兔抗大鼠VEGF、bFGF一抗（1∶500），4 ℃搖床孵育過夜，洗滌，加入山羊抗兔二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h，暗室中顯影、定影，凝膠成像系統掃描，目的蛋白表達量以其條帶灰度值/內參GAPDH條帶灰度值表示。

1.7 統計學方法 采用SPSS 21.0軟件分析數據，計量資料以“均數±標準差”（）表示，多樣本比較采用單因素方差分析，兩兩樣本比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠神經功能評分比較 假手術組大鼠均無神經功能缺損；與模型組比較，低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠神經功能評分均明顯降低（P＜0.05），且具有劑量依賴性；與低劑量組比較，中劑量組大鼠神經功能評分明顯降低（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組大鼠神經功能評分明顯降低（P＜0.05）。（見圖1）

圖1 各組大鼠神經功能評分比較（，n=10）

2.2 各組大鼠硬膜下血腫體積比較 與模型組比較，低劑量組、中劑量組和高劑量組大鼠硬膜下血腫體積明顯縮小（P＜0.05），且呈劑量依賴性；與低劑量組比較，中劑量組大鼠硬膜下血腫體積明顯縮小（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組大鼠硬膜下血腫體積明顯縮小（P＜0.05）。（見圖2）

圖2 各組大鼠硬膜下血腫體積比較（，n=10）

2.3 各組大鼠新生血管密度比較 采用免疫組織化學染色檢測血管標志蛋白CD31蛋白表達，CD31蛋白標記的新生血管內皮細胞陽性染色為棕黃色或棕褐色。結果顯示與假手術組比較，模型組大鼠CD31蛋白表達增加；與模型組比較，低劑量組大鼠CD31蛋白表達減少；與低劑量組比較，中劑量組大鼠CD31蛋白表達減少；與中劑量組比較，高劑量組大鼠CD31蛋白表達減少。（見圖3）

圖3 各組大鼠硬膜新生血管密度比較（免疫組化，×200，標尺50 μm）

與假手術組比較，模型組大鼠血腫外膜新生血管密度明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組大鼠血腫外膜新生血管密度明顯降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，中劑量組大鼠血腫外膜新生血管密度明顯降低（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組大鼠血腫外膜新生血管密度明顯降低（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠新生血管密度比較（）

表1 各組大鼠新生血管密度比較（）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與低劑量組比較，cP＜0.05；與中劑量組比較，dP＜0.05

2.4 各組大鼠硬膜組織病理變化情況 假手術組大鼠硬膜組織染色較淺，未觀察到血腫及炎癥反應；模型組大鼠硬膜組織顏色深暗，可觀察到大量血腫，以及炎癥細胞浸潤、組織增生；低、中劑量組大鼠硬膜組織血腫開始吸收，血腫與腦皮層間逐漸形成包膜，血腫內可觀察到機化組織；高劑量組大鼠硬膜組織血腫被大部分吸收，內膜與外膜間僅可觀察到薄層血腫，血腫內可觀察到機化組織。（見圖4）

圖4 各組大鼠硬膜組織病理變化情況（HE，×100，標尺100 μm）

2.5 各組大鼠硬膜組織中VEGF、bFGF蛋白表達水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠硬膜組織中VEGF、bFGF蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，低劑量組大鼠硬膜組織中VEGF、bFGF蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.05）；與低劑量組比較，中劑量組大鼠硬膜組織中VEGF、bFGF蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組大鼠硬膜組織中VEGF、bFGF蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.05）。（見圖5～6）

圖5 各組大鼠硬膜組織中VEGF、bFGF 蛋白表達Western blotting 圖

圖6 各組大鼠硬膜組織中VEGF、bFGF 蛋白相對表達量比較（，n=10）

3 討論

CSDH是一種常見的神經外科疾病，血腫位于硬膜下腔中，占位血腫通過壓迫腦組織導致其缺血、缺氧，并改變血腦屏障通透性從而引發一系列繼發性損害[7]。研究顯示[8-9]，高齡，頭部外傷，酗酒，抗凝或抗血小板治療，顱內病損，以及顱內壓持續降低等均是CSDH發生的常見危險因素。目前，鉆孔引流術是臨床治療CSDH的主要方式，但因該病發病位置特殊且好發于老年群體，整體療效并不理想，且術后復發率較高[10]。CSDH在中醫學中屬“頭痛”范疇，頭部創傷傷及腦絡，瘀血內滯、阻滯腦絡是其主要病因，故治療應以化瘀通絡為主[11]。海風藤是常用的通絡藥物，其活性單體化合物在CSDH中的治療意義及機制備受關注。

血腫包膜血管新生在CSDH發展過程中具有重要作用[12]。CSDH包膜質地厚，纖維蛋白溶酶原與新生毛細血管豐富，但因新生血管內皮細胞結構不完整、基膜不成熟，可反復生成與出血，并大多是畸形血管，通透性強，可刺激硬膜邊緣細胞持續增生并不斷形成新膜，導致血腫進一步增大[13-15]。本研究結果顯示，與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠神經功能評分、血腫外膜新生血管密度均明顯降低，血腫體積明顯縮小，且呈劑量依賴性，提示海風藤醇提取物可促進大鼠神經功能的改善及血腫吸收，并抑制血管新生。海風藤具有抗炎、抗氧化、鎮痛、抑制血小板活化、保護局部缺血組織等藥理作用。從海風藤中分離的醇提取物主要包括黃酮類、生物堿、木質素類、環氧化合物、揮發油等，血小板活性因子拮抗作用極強，而血小板活性因子是CSDH腦損傷進程中關鍵的病理介質，推測海風藤醇提取物可有效阻止CSDH病理損傷過程，促進血腫吸收。

VEGF是目前已知的最為強效的血管生成促進因子，bFGF是最為有效的血管生成因子，兩者具有明顯的促進血管內皮細胞增殖與管腔形成作用，明顯高表達于CSDH血腫腔及硬膜中，并參與血腫轉歸，可作為反映機體血管新生及修復功能的敏感指標[16]。有報道顯示[17]，CSDH血腫壁中高VEGF表達的患者，面臨著更高的鉆孔引流術后復發風險，推測原因為其異常升高可擾亂血腫壁功能紊亂并致其血管增生，且明顯增加微血管通透性。本研究結果顯示，與模型組比較，低、中、高劑量組大鼠硬膜組織中VEGF、bFGF蛋白相對表達量明顯降低，且呈劑量依賴性，提示海風藤醇提取物對CSDH的治療作用可能通過抑制VEGF、bFGF表達來實現。

綜上所述，海風藤醇提取物可改善CSDH大鼠神經功能，抑制其血管新生，且表現為劑量依賴性，推測其作用機制與抑制硬膜VEGF、bFGF表達有關。海風藤醇提取物對CSDH的作用靶點是否存在多途徑尚未明確，仍需進一步研究。此外，本研究未使用VEGF、bFGF激活劑對機制進行深入探索，將在后續實驗中展開。