動物疫病監測及注意事項

劉娜

（河北省饒陽縣動物疫病預防控制中心河北衡水 053900）

動物疫病監測是一種主動、系統深入的資料記錄形式，是指對某種或某些疫病（包括傳染病和非傳染?。╅L期、完整、連續定期的觀察，收集，核對，分析疫病動態分布和影響因素資料，跟蹤疫病的發生、分布和變化趨勢，并將信息及時上報和反饋，以便進一步開展調查研究，對疫病進行預警預報，提出有效的防控對策和措施，從而達到防控疫病的目的。

疫情監測方案具體到日常上級下達的監測任務和跨省調運需要監測的臨時監測，及每年春秋季防疫后的集中監測。動物疫病監測一直以來是動物疫病預防控制的主要內容之一，有效的動物防疫以及動物疫病監測，能夠保證相關養殖人員及時地掌握動物生長實際，并及時掌握疫病和疫情的實際狀況，結合實際和現有的防疫手段、監測手段等，去進行免疫工作，可依據檢測記錄去及時調整防疫措施、控制疫情。現就今年春季奶牛口蹄疫集中免疫抗體監測為例闡述如下。

1 采集樣品具體信息

某翔和某凱兩家奶牛養殖企業，采樣奶牛日齡均為成年泌乳牛，采樣數量均為60 份。某凱奶牛場免疫的是中農威特的口蹄疫疫苗，免疫時間為2021 年4 月15 日。某翔奶牛場免疫的是天康生物股份有限公司的口蹄疫疫苗，免疫時間為2021 年3 月1 日。臨床表現均為采食正常，健康牛。試劑盒采用的是青島立見診斷技術發展中心生產的口蹄疫病毒O 型競爭ELISA 抗體檢測試劑盒和蘭州獸研生物科技有限公司生產的改進型口蹄疫病毒O 型液相阻斷ELISA 抗體檢測試劑盒。

2 試驗準備

試劑盒、樣品放置室溫25℃平衡30min 以上；恒溫箱調至37℃；洗滌液按說明書倍數稀釋；酶標儀調至450nm 狀態；實驗操作在血清學實驗室生物安全柜進行；移液器按所需量程準備；嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

2.1 口蹄疫病毒O 型競爭ELISA 抗體檢測

酶標儀讀取數據陰性血清對照值為2.494 和2.509，陽性血清對照值為0.095 和0.086，陰性血清的平均OD 值為2.5015，大于0.5，且陽性血清抑制率為96.3%，大于50%，試驗結果有效，試驗成立。讀取數值結果，某凱奶牛場的樣品數值在0.052～0.203 之間，經判定全部樣品為陽性。某翔奶牛場的樣品數值在0.605～0.819 之間，經判定樣品全部為陽性。

2.2 改進型口蹄疫病毒O 型液相阻斷ELISA 抗體檢測

采取的20 份樣品的布局，加入病毒抗原后樣品血清的稀釋度第一孔為1：16，然后倍比向下稀釋至1：128。陽性對照的稀釋度為1：32，然后倍比向下稀釋至1：4096。陰性對照血清設兩個孔稀釋度分別為1：4 和1：8。酶標儀讀取數據陰性血清對照值為1.818 和1.879，病毒抗原對照值為2.101、2.078、2.117、2.085，陽性血清對照一列數值依次為0.102、0.136、0.235、0.495、0.925、1.434、1.702、1.974。依據試驗成立條件：病毒抗原對照D450nm 值在1.0以上。陽性對照抗體效價在1：1024± 1 滴度以內。陰性對照血清抗體效價＜1：8，試驗結果有效，試驗成立。讀取數值結果，某翔奶牛場的樣品第一排稀釋度1：16 數值在0.081～0.269 之間，第四排稀釋度1：128 數值在0.104～0.301 之間。經判定全部樣品為陽性。牛抗體效價均≥1：128，99%以上保護。某凱奶牛場的的樣品第一排稀釋度1：16 數值在0.077～0.131 之間，第四排稀釋度1：128數值在0.167～0.360 之間，經判定樣品全部為陽性。牛抗體效價均≥1：128，99%以上保護。

2.3 兩種試劑盒的比較

口蹄疫病毒O 型競爭ELISA 抗體檢測是定性檢測，只能判斷免疫的奶牛血清中抗體是否產生，不能判斷免疫的奶?？贵w的保護率。操作快捷，用時較短，樣品布板份數多。改進型口蹄疫病毒O型液相阻斷ELISA 抗體檢測是定量檢測，能精準到保護率高低多少。但同時操作的份數較少，相對用時就會長些。

3 注意事項

1）血清的采集。采集過程中防止溶血，溶血會導致吸光度升高，影響檢測結果。血液應在室溫中凝固20～30min，然后2,000～3,000r/min 離心，取上清部分，血清量應足夠檢測所需。

2）移液器。使用的移液器要定期校準，確保試劑用量精準，檢測數據的精準。

3）吸頭：配合移液器量程使用。每個標準品與待測樣品不能重復使用同一個吸頭加樣。加入不同樣品和不同試劑成分時，應該更換移液器吸頭，以避免出現交叉污染。

4）洗滌液、稀釋液配置以及盛放洗滌液的容器應保持清潔，以防止微生物污染導致非特異性反應。按照說明書的比例配制洗滌液。如20 倍稀釋，即1mL 濃縮洗滌液加入19mL 蒸餾水。稀釋后的洗液可在室溫下保存24h。如果出現結晶物，可放置于37℃恒溫箱內5～10min。濃縮洗滌液出現渾濁或絮狀物請勿使用。

5）加樣：調整移液器刻度，設定容量值。移液器移取液體試劑和樣品血清。吸取液體時，移液器保持豎直狀態，將吸頭插入液面下2～3mm，用大拇指將移液器頂部按鈕按至第一停點，然后慢慢松開按鈕回原點，接著將按鈕按至第一停點排出液體稍停片刻繼續按按鈕至第二停點吹出殘余的液體后松開按鈕。使用多道（如8道或12 道）移液器，則可以將移液器的第一道對準第一個槍頭，然后傾斜插入，前后方向搖動即可卡緊，避免用重力撞擊，吸頭卡緊后可看到連接部分形成清晰的密封圈。

6）處理大批量樣本時，首孔與末孔加樣時間間隔過長會導致各微孔間有不同的起始反應時間，從而影響到測量值的準確性和重復性。為保證不同樣品的孵育時間一致，可先取待檢樣品、FDMV AC 陰性血清、FDMV AC 陽性血清不低于10μl 分別加入96孔板中并做好記錄，然后用多道移液器移至FDMV AC 抗原包被板相應孔中。也可在抗原包被板直接加樣。

7）微量振蕩：對微孔內的混合溶液進行充分混勻。將已用封口貼封閉的微孔板平穩牢固的放置于微量振蕩器的載物平臺上，以中等檔位的力度震蕩30s。手工混勻：單手握微孔板架長邊兩側，在實驗操作臺上向左右輕輕平行搖晃60s，使混合液體均勻。將已密封的微孔板放置于室溫或恒溫箱37℃中溫育反應。

8）溫育：在溫育前將封口貼緊覆蓋在微孔板上，確保無縫隙，將密封好的微孔板放置在37℃的恒溫箱內，為了能夠使試劑得到充分的反應，溫育的溫度非常重要。

9）洗滌：①手工清洗微孔板內的殘余物質。將提前配置的洗滌液加入移液槽里，然后快速甩掉微孔板內反應液于廢液池內，用300μL量程的多道移液器吸取280μL 洗滌液，在微量血凝板上方傾斜45 度以吸頭出水口對準微孔逐一沖洗3～5 次（依據日常操作習慣微孔板近身端可微微平行向右偏移10°左右，更利于移液器吸頭對準微孔板各孔進行洗板），將各孔注滿洗液，靜置1min，甩掉微孔板內洗液，按照以上步驟重復3 次。手工清洗應注意沖洗水流的力度適中，不宜過大。洗滌時各孔均需加滿洗滌液（不能過滿，防止溢出），防止孔口有游離的物質不能洗凈。洗板結束后必須立即拍打干凈，不可使酶標板自然干燥。②洗板機：自動清洗微孔板內的殘余物質。將提前配置的洗液加入自動洗板機的洗液瓶里，然后快速甩掉微孔板內反應液于廢液池內，使用洗板機洗板3 次，每次浸泡1min，清洗后拍干反應板。洗板機噴水口很容易被洗液形成的結晶物堵塞，造成各孔間較大差異，因此應當注意按時對洗板機進行清潔保養。

10）避光裝置：底物溶液B 應避光保存，底物溶液使用時應該現用現配，如出現變色，應棄之不用。操作中應將加入顯色劑的微孔板放置在無雜物的抽屜或盒子內，使外部可見光無法照射到即可。

11）拍板；在清洗微孔后，將微孔板倒置在吸水紙上（一般采用的方法是無菌紗布折疊數層），單手握緊吸水紙與微孔板的側面邊緣，微孔板面向下，用力拍打，將附著在微孔壁和微孔底上的殘余液體吸附干凈（不可以將吸水紙直接放入微孔中），同時還要清除板底殘留的液體和手指印。徹底的清洗和拍干，可以提高吸光度數值讀取的精準性。

12）酶標儀讀數：讀取微孔板內各孔液體的吸光度。濾光片應設置檢測波長為450nm。測定結果以酶標儀讀數為準，讀取結果時，應擦干酶標板底部，且微孔內不能有氣泡。不要觸碰孔底部的外壁，輕微的指印和劃痕都可能影響最終的讀數。

13）通常意義上的室溫是指18～25℃的環境。如果溫差在±5℃時，應使用空調裝置調節室內溫度以達到試驗要求。

14）不同批號的特異性試劑不可混用，通用試劑可以交互使用，不可以與其他廠商的試劑混用，超過有效期限的試劑不可使用。

15）所有樣品、廢液和廢棄物都應按照傳染物處理銷毀。

綜上所述，動物疫病監測工作需要操作細致入微，儀器精準可靠。既要保護操作者自身安全又確保監測的價值。監測是依靠正確的操作和規范，從技術的角度提取各種數據和指標，經過量化處理，預先對動物疫病的種類、危害情況、病情發展情況等均予以了解，并且還可有效控制動物疫病的發生與發展，避免出現動物疫病大規模暴發情況。為后續動物疫病防控，提供一定的參考價值和解決措施。但當前，在畜禽養殖業發展過程中，廣大養殖戶對動物疫病的監測不夠重視，需要下鄉入戶進行宣傳普及知識，讓養殖戶對動物疫病監測有一個正確的認識，積極采取適合自場的有效的監測方案，制定適合自場的防疫措施，從而降低疫病發病幾率，提高疫病監測的治療和效果，促進養殖業的可持續發展。