一株豬流行性腹瀉病毒的分離鑒定

姚春陽，徐文豪，馬先強

（1.山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院山東濱州 256600；2.濱州市濱城區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心山東濱州 256600；3.惠民縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村服務(wù)中心山東濱州 251700）

豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea vrus，PEDV）可導(dǎo)致哺乳仔豬中引起嚴重的腸炎、水樣腹瀉、嘔吐、脫水直到死亡，通常稱為“冬季拉稀病”、“打水槍”，育肥豬、母豬對該病毒有抵抗力，能耐過。20 世紀(jì)70 年代，豬流行性腹瀉（PED）作為一種急性腸道傳染病首先在英國出現(xiàn)[1]，隨后，該病在捷克共和國、匈牙利、韓國、意大利、泰國、中國、美國等許多國家暴發(fā)。我國是生豬養(yǎng)殖大國，自2010 年底以來PEDV 變異株在我國各地豬群中大規(guī)模暴發(fā)流行，大量仔豬患病死亡，特別是對3 日齡之內(nèi)的仔豬病死率可達100%，給我國造成了巨大的經(jīng)濟損失[2]。

PEDV 病毒粒子核酸為線性單股正鏈RNA，作為一種α 冠狀病毒，在糞便中病毒粒子是多形態(tài)的，趨于圓形，病毒顆粒表面有纖突，平均直徑（包括纖突）在130nm 左右，PEDV 僅在病豬小腸黏膜上皮細胞中繁殖，只有一種血清型。PEDV 基因組全長28kb左右，纖突S 蛋白、核衣殼N 蛋白、囊膜E 蛋白及膜M 蛋白是其主要結(jié)構(gòu)蛋白，其中S 蛋白由1383 個氨基酸組成，在PED 的流行中，S 蛋白的S1 區(qū)常常發(fā)生變異，根據(jù)這一特征性變異可區(qū)分經(jīng)典毒株和變異毒株，并為疫苗的選擇提供理論依據(jù)。本試驗從山東省某豬場暴發(fā)仔豬腹瀉疫病的發(fā)病豬群中采集糞便樣品，在Vero 細胞中進行了病毒的分離、RT－PCR 鑒定及測序分析，證實所分離毒株為PEDV 變異株。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病料采自山東省某豬場疑似暴發(fā)PEDV 豬群的仔豬腹瀉糞便，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細胞及主要試劑

Vero 細胞為本實驗室保存；TRIGene 總RNA 提取試劑為GeneStar 產(chǎn)品，DL2000DNA Marker、pMD18-T 載體、一步法RT-PCR 相關(guān)試劑為寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司產(chǎn)品，DNA凝膠回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒為愛思進生物技術(shù)（杭州）有限公司產(chǎn)品；新生牛血清為Biolological Industry 產(chǎn)品、DMEM 干粉培養(yǎng)基和胰酶為Gibco 公司產(chǎn)品、S 蛋白單克隆抗體購自韓國金諾公司；FITC 標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗購自Abcam 公司。

1.2 方法

1）糞便的RT-PCR 檢測糞便樣品經(jīng)無菌生理鹽水（體積比約1：5）重懸離心后取上清液，使用TRIGene 總RNA 提取試劑提取上清液中病毒核酸，使用PEDV 鑒定引物[3]（表1）對提取的核酸進行檢測。反應(yīng)體系：2X 一步法RT-PCR 試劑12.5μL，上、下游引物混合液2μL（PEDV-F 與PEDV-R 引物10μM）、提取總RNA 3μL，加入滅菌水補充至總體積為25uL。

反應(yīng)程序：50℃ 10min，95℃預(yù) 變 性5min；95℃變 性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30 個循環(huán)，再進行72℃延伸5min，4℃終止反應(yīng)。

2）病毒的分離 檢測為陽性的離心上清液樣品用0.45μm 無菌濾器過濾除菌后接種于Vero 細胞，于37℃的CO2（5%）培養(yǎng)箱中恒溫恒濕培養(yǎng)，每天觀察細胞病變（CPE）。連續(xù)體外傳代3～5代。

3）分離毒株S1 基因擴增及序列分析利用S1 基因擴增引物[4]（表1）對分離毒株進行S1 基因的擴增（反應(yīng)體系和程序同1.2.1），經(jīng)膠回收后連接PMD18-T 載體，經(jīng)鑒定后送往并測序分析。

表1 引物序列及長度

4）PEDV S1 基因序列核苷酸同源性分析利用DNAstar 軟件對S1 基因測序結(jié)果進行基因信息比對分析，與GenBank 中已上傳的國內(nèi)外部分PEDV 參考毒株S1 基因序列進行同源性比對和遺傳進化分析。

2 結(jié)果

2.1 糞便的RT-PCR 檢測

4 份腹瀉仔豬病料處理后，提取核酸，經(jīng)RT-PCR 檢測后2 份樣本擴增出了492bp 左右大小的目的條帶，如圖1 所示

圖1 PEDV RT-PCR 鑒定及分離毒S1 基因的擴增

2.2 病毒的分離

病料上清液樣接種于Vero 細胞，于37℃的CO2（5%）培養(yǎng)箱中恒溫恒濕培養(yǎng)，連續(xù)體外傳代4 代后出現(xiàn)了典型的合胞體病變，呈現(xiàn)變圓、融合等現(xiàn)象（圖2b），間接免疫熒光試驗證實，該分離株可以與PEDV 特異性單抗發(fā)生反應(yīng)（圖2c）。收取病毒液后繼續(xù)進行傳代培養(yǎng)，最終獲得1 株能夠在Vero 細胞上穩(wěn)定傳代的PEDV毒株。

圖2 PEDV 分離株分離鑒定

2.3 分離毒株S1 基因擴增及序列分析

提取分離病毒的病毒RNA，通過RT-PCR 成功擴增出分離株S1 基因片段，大小約2376bp，與預(yù)期相符，如圖1 所示，PCR 產(chǎn)物經(jīng)回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測序結(jié)果表明該PEDV 分離株為一變異毒株，NCBI blast 分析表明該分離株與G2-b 亞群分離株同源性最高，在98.5%以上，表明分離毒株為PEDV G2-b 亞群。

3 討論

PEDV 在細胞上分離培養(yǎng)一直是研究的熱點問題，1988 年，Hofmann 等首次通過次通過在Vero 細胞培養(yǎng)液中添加一定濃度的胰酶成功分離出PEDV，隨后眾多國內(nèi)外學(xué)者相繼報道了成功在Vero 細胞上分離到PEDV，但分離病毒的成功率一直不高。由于PEDV 病毒屬于RNA 病毒，變異較快，傳統(tǒng)的弱毒疫苗和滅活疫苗到一定時期將不能對仔豬起到有效的保護作用。因此，快速分離和鑒定當(dāng)前流行的PEDV 毒株平臺的建立，可以輔助針對當(dāng)前流行毒株的疫苗的開發(fā)，用于PEDV 流行株的預(yù)防和控制。近幾年來，我國眾多學(xué)者在PEDV 分離平臺建設(shè)方面取得較快發(fā)展，已成功分離到眾多豬流行性腹瀉流行株，2017 年龐文靜從陜西省某養(yǎng)豬場發(fā)病仔豬病料中分離到1 株P(guān)EDV 病毒，該分離毒用Vero 細胞盲傳至8 代以后出現(xiàn)較為穩(wěn)定的細胞病變，經(jīng)RT-PCR 鑒定及測序分析，最終確定該分離毒株為PEDV，將其命名為PEDV HZ 株[5]。2018 年吳白等人從山東某暴發(fā)腹瀉的豬場腹瀉糞便中分離到一株P(guān)EDV 分離株，該分離株口服接種3 日齡仔豬后可以出現(xiàn)典型的PED 臨床癥狀[3]。2019 年唐融志等人從山東莒縣某豬場發(fā)病小豬腸道內(nèi)容物及糞便中分離到一株P(guān)EDV[4]，2020 年王曉斐等人從河南焦作某豬場哺乳仔病料中分離到PEDV[6]，2021 年王娜等人從上海地區(qū)某豬場發(fā)病仔豬病料中分離到豬流行性腹瀉流行毒株，該分離毒屬于重組毒株G2-b 亞群，與近年來強毒株S 蛋白的氨基酸序列較為一致[7]。本研究用實驗室Vero e6 細胞，基于建立的RT-PCR 檢測技術(shù)建立起了PEDV 分離平臺，成功分離到了一株P(guān)EDV 流行毒株，該毒株為變異毒株，毒株的成功分離為更好的了解和掌握PEDV 在山東的流行狀況和對PED 疫苗的選擇提供數(shù)據(jù)支持和物質(zhì)基礎(chǔ)。