miR-3679-5p通過抑制FOXM 1表達對食管癌KYSE30細胞增殖和凋亡的影響

雷蕾 何小俊 李薇薇 王寶英 鄭安銳 黃耿鄂東醫療集團黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院）消化內科 45000；武漢大學湖北省人民醫院，武漢 40060；鄂東醫療集團黃石市中心醫院（湖北理工學院附屬醫院）泌尿外科 45000

食管癌是全球常見的消化系統惡性腫瘤，呈明顯的地域性分布［1］。食管癌早期的癥狀如異物感容易被患者忽略，進展為晚期后多數患者失去手術機會，5年生存率不到20%［2］。因此，探究食管癌發生和發展的分子機制具有重要臨床意義。研究顯示，在細胞內存在眾多微小RNA（miRNA），miRNA通過抑制或者直接降解靶基因信使RNA（mRNA）表達，影響靶基因的表達，調節細胞的分化、發育、增殖及凋亡等細胞活動［3-5］。miRNA的異常表達與食管癌細胞的放療敏感性、細胞活力密切相關［6］。研究證實，miR-3679-5p在結直腸癌細胞中發揮抑癌基因作用［7］。關于miR-3679-5p在食管癌細胞中的作用研究尚未見報道。本研究旨在探討miR-3679-5p對食管癌細胞增殖和凋亡中的影響及可能的分子機制。

1 資料與方法

1.1 材料和試劑 食管癌細胞KYSE30購自中國科學院上海細胞庫；RPMI-1640培養基、胎牛血清（FBS）購自美國Hyclone公司；陰性對照模擬物和miR-3679-5p模擬物均由北京天根生化科技有限公司設計并合成；熒光實時定量聚合酶鏈式反應（RT-qPCR）試劑盒和引物購自大連寶生物工程有限公司；Lipofectamine?RNAiMAX轉染試劑購自美國Invitrogen公司；Trizol試劑盒和雙染流式細胞術試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司；一抗CDK1、Bcl-2、Bcl-w、β-actin、叉頭框蛋白M1（forkhead box protein M1，FOXM1）購自美國BD公司。

1.2 細胞培養和轉染 在37℃、5%CO2條件下，KYSE30細胞采用含10%FBS的RPMI-1640培養基培養。選取對數生長期KYSE30細胞接種于24孔板，待細胞匯合50%時，根據Lipofectamine?RNAiMAX轉染試劑說明書，將陰性對照模擬物和miR-3679-5p模擬物轉染KYSE30細胞，培養8 h后更換培養基。

1.3 RT-qPCR檢測KYSE30細胞中miR-3679-5p和FOXM1 mRNA的表達水平 采用Trizol試劑盒提取KYSE30細胞總RNA，逆轉錄成cDNA。以U6或GAPDH為內參，進行擴增檢測，采用2-△△CT法計算miR-3679-5p和FOXM1 mRNA相對表達水平。引物序列：FOXM1正向引物：5’-CGTCGGCCACTGATTCTCAAA-3’，反 向 引 物：5’-GGCAGGGGATCTCTTAGGTTC-3’；U6正 向 引 物：5’-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3’，反 向 引 物：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3’；GAPDH正向引物：5’-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3’，反 向 引 物：5’-GCCATCACGCCACAGTTTC-3’；miR-3679-5p正向引物：5’-TTCCCTGCCATATCCTCA-3’，反 向 引 物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’，實驗重復4次。

1.4 克隆形成實驗檢測KYSE30細胞的增殖能力 取待測KYSE30細胞，將細胞以1×103個/孔接種于96孔板，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，培養14 d后，肉眼可見克隆形成后停止培養，每孔加入1 ml甲醛固定細胞，加入1 ml結晶紫溶液染色。流水沖去殘余染液，室溫下晾干，拍照并計數每組克隆形成數，實驗重復4次。

1.5 雙染流式細胞術檢測KYSE30細胞的凋亡 收集各組待測KYSE30細胞，采用磷酸緩沖鹽溶液清洗，加入600μl結合緩沖液重懸，加入10μl Annexin V-FITC試劑孵育10 min，加入10μl PI試劑孵育10 min，采用流式細胞儀檢測各組KYSE30細胞的凋亡水平，實驗重復4次。

1.6 生物信息學方法預測miR-3679-5p的靶基因采用在線miRNA預測軟件starBase v2.0（http：//starbase.sysu.edu.cn/starbase2/index.php）預測miR-3679-5p可能調控的靶基因。

1.7 Western blotting檢測FOXM1蛋白表達水平 收集各組待測KYSE30細胞，加入600μl細胞裂解液提取總蛋白。每組取30μg蛋白樣本采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白條帶，電轉法將目的蛋白轉至硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶封閉1.5 h，加入一抗在4℃下孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗，在室溫下孵育1.5 h。加入化學增強型發光液顯影、拍照。

1.8 統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件分析，計量資料符合正態分布，以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組細胞中miR-3679-5p的表達水平 RT-qPCR檢測結果（圖1）顯示，miR-3679-5p組和NC組KYSE30細胞中miR-3679-5p的相對表達水平分別為（8.65±0.68）和（1.09±0.31），miR-3679-5p組KYSE30細胞中miR-3679-5p的表達水平較NC組明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.01）。

圖1 miR-3679-5p組和NC組KYSE30細胞中miR-3679-5p的表達水平

2.2 過表達miR-3679-5p對KYSE30細胞增殖能力的影響 克隆形成實驗結果（圖2）顯示，NC組和miR-3679-5p組克隆形成數分別為（105.70±13.57）個和（48.46±12.79）個，差異有統計學意義（P＜0.05），提示過表達miR-3679-5p可降低KYSE30細胞的增殖能力。

圖2 克隆形成實驗檢測兩組KYSE30細胞的增殖能力

2.3 過表達miR-3679-5p對KYSE30細胞凋亡能力的影響 雙染流式細胞術檢測結果（圖3）顯示，NC組和miR-3679-5p組KYSE30細胞凋亡率分別為（5.48±1.34）%和（19.37±2.66）%，差異有統計學意義（P＜0.01），提示過表達miR-3679-5p可促進KYSE30細胞的凋亡。

圖3 雙染流式細胞術檢測兩組KYSE30細胞的凋亡能力

2.4 生物信息學方法預測miR-3679-5p的靶基因通過在線miRNA預測軟件starBase v2.0預測顯示，FOXM1可能是miR-3679-5p直接的作用靶點，miR-3679-5p和FOXM1的結合位點見圖4。

圖4 starBase v2.0在線軟件預測miR-3679-5p與叉頭框蛋白M1（FOXM1）的結合區域

2.5 兩組KYSE30細胞中FOXM1 mRNA的表達水平RT-qPCR檢測結果顯示，miR-3679-5p組和NC組KYSE30細胞中FOXM1 mRNA的相對表達水平分別為（0.18±0.04）和（1.02±0.07），miR-3679-5p組KYSE30細胞中FOXM1 mRNA的表達水平較NC組明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.01），提示過表達miR-3679-5p能夠抑制FOXM1的表達。

2.6 兩組KYSE30細胞中FOXM1蛋白的表達 如圖5，與NC組相比，miR-3679-5p組KYSE30細胞中miR-3679-5p表達升高后，FOXM1蛋白表達顯著降低，增殖表型蛋白CDK1表達下調，凋亡表型蛋白如Bcl-2、Bcl-w表達下調。

圖5 Westernblotting檢測兩組KYSE30細胞叉頭框蛋白M1（FOXM1）蛋白表達

3 討 論

近年來大量研究發現，miRNA在鼻咽癌、淋巴瘤、骨肉瘤等各種惡性腫瘤中表達上調或下調，負責調節腫瘤細胞的惡性生物學行為，在腫瘤的發生及進展過程中扮演重要角色［8-10］。越來越多的miRNA被發現在食管癌中異常表達，表現為抑癌基因或癌基因作用［11］。Gao等［12］報道，miR-105在食管癌組織和細胞系中表達上調，miR-105過表達與淋巴結轉移、臨床分期和總生存率顯著相關，miR-105過表達促進食管癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Wu等［13］報道，食管癌腫瘤組織和細胞中miR-10b表達上調，抑制miR-10b可增強食管癌細胞在體外和體內對順鉑的化學敏感性。Li等［7］研究表明，miR-3679-5p在結直腸癌細胞中是一個抑癌性miRNA。miR-3679-5p在食管癌中功能并不清楚。

本研究發現，過表達miR-3679-5p可抑制食管癌KYSE30細胞的增殖并促進其凋亡，發揮抑癌基因功能。miRNA可靶向互補結合并抑制靶基因表達，調控細胞的增殖和凋亡［14］。本研究通過生物信息學預測顯示，FOXM1可能是食管癌細胞中miR-3679-5p的作用靶點。FOXM1基因定位于12p13.3，其蛋白由110個氨基酸組成，FOXM1蛋白是FOX轉錄因子家族蛋白成員［15］。FOXM1在乳腺癌、胰腺癌、結直腸癌等多種腫瘤組織中高表達，促進腫瘤的發生和發展［16-17］。FOXM1蛋白在食管癌組織中表達上調，抑制FOXM1表達可顯著抑制食管癌細胞的增殖和轉移［18］。本研究采用RT-qPCR檢測顯示，上調miR-3679-5p表達后，FOXM1表達明顯降低。miR-3679-5p可顯著抑制FOXM1的表達。本研究進一步發現，FOXM1蛋白表達下調后，KYSE30細胞增殖表型蛋白CDK1表達下調，KYSE30細胞凋亡表型蛋白如Bcl-2、Bcl-w表達下調，提示miR-3679-5p表達上調可抑制KYSE30細胞增殖并促進其凋亡。

綜上所述，miR-3679-5p在食管癌組織和細胞株中表達下調，FOXM1是食管癌中miR-3679-5p的直接作用靶點，過表達miR-3679-5p可通過下調FOXM1的表達，抑制食管癌KYSE30細胞的增殖和凋亡。miR-3679-5p可能是食管癌潛在的分子治療靶點。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。