RNA m6A甲基化修飾對三氧化二砷抑制肝癌細胞發生的作用研究

伍鑫 張琰君 國濱 徐振華 肖靜麗

廣州中醫藥大學金沙洲醫院 510000

通信作者：伍鑫，Email：8035192@qq.com

m6A甲基化修飾是RNA修飾中普遍存在的一種方式，其對維持mRNA的功能方面具有重要作用。m6A甲基化修飾具有可逆性，其發生三種調節因子如甲基轉移酶14/3（METTL14/METTL3）、去甲基化酶（FTO/alkbh5）和閱讀蛋白（YTHDF1/YTHDF2）等進行調節［1］。目前大量研究發現，m6A不僅參與正常細胞的生長調控，同時還參與腫瘤細胞的發生及發展，m6A甲基化紊亂容易增加腫瘤細胞的癌變［2-3］。肝癌是危害性較大的惡性腫瘤疾病，有研究發現FTO通過調控m6A修飾從而影響肝癌的發生，肝癌組織中FTO水平上調可有效抑制肝癌的生長，METT14表達水平降低可引起肝癌細胞中m6A修飾水平下降［4］。基于m6A修飾及調控因子與腫瘤細胞發生相關性，許多腫瘤治療藥物的藥效評定中多以m6A修飾及調控因子變化為參照，如三氧化二砷（ATO）是目前治療肝癌的常用藥物，但其抗肝癌的機理目前尚不清楚，有少量研究發現m6A甲基化修飾參與ATO抑制肝癌治療過程，但這些信號分子調控m6A抑制肝癌細胞生長的還需進一步研究［5］。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 高糖DMEM培養基（美國Gibco公司，11054001）、FBS（美國Gibco公司，12483020）、ATO（美國Sigma公司，CAS#1327-53-3）、噻唑藍（MTT）（碧云天，C0009）、二甲基亞砜（DMSO）（碧云天，ST1276）、CCK-8檢測試劑盒（英國Abcam公司，ab228554），總RNA提取試劑盒（德國Qiagen公司，74204）、m6A RNA甲基化定量檢測試劑盒（美國Epigentek公司，P-9010）、RIPA細胞裂解液（碧云天，P0013B），人肝癌細胞株HepG2（中科院生物化學與細胞生物學研究所）；METTL3兔抗（英國Abcam公司，ab195352）、METTL14兔抗（英國Abcam公司，ab252562）、FTO兔抗（英國Abcam公司，ab126605）、YTHDF1兔抗（英國Abcam公司，ab252346）及CDC42兔抗（英國Abcam公司，ab187643），GAPDH鼠抗（英國Abcam公司，ab8245）；酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司，型號MK3）、核酸定量檢測儀Nano Drop（美國Thermo Fisher Scientific公司，型號Nanodrop one/Nanodrop onec）、CO2培養箱（日本三洋，型號MCO-15AC）。

1.2 細胞四甲基偶氮唑藍（MTT）活力檢測 將人肝癌細胞株HepG2體外擴增后稀釋至1×105個/ml接種于6孔板中4 ml/孔，繼續培養至覆蓋孔底70%左右，棄細胞上清，依據相關報道加入含有終濃度為20μM ATO的DMEM完全培養基，同時設立只加DMEM完全培養基的空白對照孔，2 ml/孔。ATO處理的HepG2細胞培養至0 h、6 h、12 h、24 h、48 h分別隨機選取3個孔，去掉細胞上清加入終濃度為0.5 mg/ml的MTT溶液2 ml/孔，繼續孵育4 h后棄掉MTT，加入2 ml/孔DMSO于搖床震蕩5 min后，以空白對照孔調零，于酶標儀上檢測OD570值，根據公式細胞存活率（%）＝（處理組OD570/空白組OD570）×100%進行計算。

1.3 m6A甲基化定量檢測 將經20μM ATO處理不同時間段的HepG2細胞用0.25%胰酶消化離心去上清后，使用總RNA提取試劑盒進行細胞總RNA提取并于NanoDrop測量A230、A260及A280值，選取A260/280比值在1.8～2.2范圍的樣品孔，留取部分于-80℃備用。同時剩余部分依據m6A甲基化定量檢測說明書將提取的總RNA進行處理，試劑盒中含有陰性及陽性對照組，經stop solution終止后的不同時間段樣本置于酶標儀上進行OD450檢測，根據公式m6A（%）＝［（OD處理組－OD陰性對照組）/200］/［（OD陽性對照組－OD陰性對照組）/2］×100%。

1.4 Western blot檢 測METTL3、METTL14、FTO、YTHDF1及Cdc42蛋白水平 將經20μMATO處理不同時間點的HepG2細胞消化離心后置于冰上加入終濃度均為1 mM蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，然后加入5×RIPA細胞裂解液輕彈管壁，充分裂解10 min后，經15 000 rpm離心10 min后棄上清（離心機型號：pico 17/21 176 mm），加入1 ml PBS沉淀重懸并轉入1.5 ml ep管中，進行BCA法蛋白濃度測定，之后于15 000 rpm離心10 min后棄上清（離心機型號：pico 17/21 176 mm），加入1 ml loading buffer于電熱浴槽98℃煮5 min使其變性。取6份等量的變性蛋白液（25μg）加入濃縮膠加樣孔中，170 V電泳1～2 h，經SDS-PAGE電泳分離蛋白后，將膠取下轉印到PVDF膜上，經5%BSA室溫封閉1 h后，分別加入1∶1 000稀釋的兔抗METTL3、兔抗METTL14、兔抗FTO、兔抗YTHDF1、兔抗Cdc42及鼠抗GAPDH，4℃過夜孵育，PBST洗膜4次約10 min，加入羊抗兔-HRP二抗和羊抗鼠-HRP二抗室溫孵育1 h，PBST洗膜4次約10 min，加入AB顯色液顯色，凝膠成像系統拍照及統計蛋白相對表達量。

1.5 統計學方法 本研究采用SPSS 19.0統計學軟件進行分析，計量資料符合正態分布，以均數±標準差（±s）表示，進行F檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 ATO處理不同時間段細胞存活率和m6A甲基化水平變化比較 由表1可知，經ATO處理后的0～24 h內，隨著處理時間延長，HepG2的細胞存活率呈顯著下降趨勢（P＜0.05），而HepG2細胞的RNA m6A甲基化水平呈顯著上升趨勢（P＜0.05）；在ATO處理后的24～48 h內，HepG2細胞存活率呈下降趨勢，RNA m6A甲基化水平呈上升趨勢，但兩個時間點的變化不顯著（均P＞0.05）。

表1 ATO處理不同時間段HepG2細胞存活率變化（%±s，n＝3）

表1 ATO處理不同時間段HepG2細胞存活率變化（%±s，n＝3）

注：ATO為三氧化二砷；a代表與0 h比較P＜0.05，b代表與6 h比較P＜0.05，c代表與12 h比較P＜0.05

指標細胞存活率m6A水平0 h 93.32±4.12 0.27±0.04 6 h 85.01±5.03a 0.58±0.09 a 12 h 49.14±5.23ab 0.96±0.10ab 24 h 24.00±4.74abc 1.21±0.11abc 48 h 18.34±3.33abc 1.43±0.24abc

2.2 ATO處理后HepG2細胞METTL3、METTL14、FTO、YTHDF1及Cdc42表達水平變化比較 由表2可知，隨著ATO處理時間增加，HepG2細胞中METTL3、METTL14、FTO、YTHDF1的相對表達量呈上升趨勢，而Cdc42呈下降趨勢；METTL3和FTO在ATO處理的12～48 h的相對表達量均顯著高于0 h（均P＜0.05），METTL14和YTHDF1在ATO處理的6～48 h的相對表達量均顯著高于0 h（均P＜0.05），Cdc42在ATO處理的6～48 h的相對表達量均顯著低于0 h（均P＜0.05）。

表2 ATO處理不同時間段HepG2細胞的METTL3、METTL14、FTO、YTHDF1及Cdc42蛋白表達量（±s，n＝3）

表2 ATO處理不同時間段HepG2細胞的METTL3、METTL14、FTO、YTHDF1及Cdc42蛋白表達量（±s，n＝3）

注：ATO為三氧化二砷；a代表與0 h比較P＜0.05，b代表與6 h比較P＜0.05

蛋白表達量METTL3 METTL14 FTO YTHDF1 Cdc42 0 h 0.43±0.07 0.44±0.08 0.38±0.06 0.44±0.07 0.76±0.08 6 h 0.56±0.10 0.63±0.09a 0.48±0.07 0.61±0.07a 0.61±0.09a 12 h 0.67±0.10a 0.79±0.09ab 0.60±0.10a 0.75±0.08ab 0.58±0.09a 24 h 0.71±0.11a 0.83±0.11ab 0.68±0.09a 0.79±0.09ab 0.51±0.09a 48 h 0.76±0.13a 0.94±0.11ab 0.73±0.11a 0.82±0.12ab 0.47±0.08a

3 討 論

RNA m6A修飾是腺嘌呤的第6位氮原子受甲基轉移酶催化發生的甲基化，此過程受3種蛋白酶參與調控，即甲基轉移酶（METTL3/METTL14）、去甲基酶（FTO）和閱讀蛋白（YTHDF）［6］。有研究發現剔除Hla細胞中METTL14后m6A甲基化水平顯著降低，但是去甲基化是否對細胞的生長有影響仍需深入研究［7］。目前有少量研究證實m6A修飾的擦除基因FTO被剔除后，細胞中mRNA的m6A甲基化水平顯著下降，在肝癌細胞的m6A研究中，抑制YTHDF1的表達更有利于提升肝癌患者的生存率，但是當METTL14過表達會抑制肝癌細胞的遷移和侵襲［8］。基于上述調控蛋白表達水平與細胞生物學功能變化的相關性報道，近年來有少量研究開始將癌癥療效判定與上述指標的變化進行深入分析，如代黃梅等［9］使用不同濃度的ATO作用于對數生長期肝癌細胞發現METTL14表達水平與肝癌細胞的m6A甲基化修飾水平呈正相關，同時ATO濃度在10～20μmol/L時的HepG2細胞存活率下降幅度最大。何佳等［10］利用CCK-8法證明ATO對HepG2的半抑制濃度（IC50）為8.0μmol/L，并證明此濃度下作用時間越長細胞的凋亡越多且HepG2細胞的遷移蛋白表達量限制下降。

本研究基于相關報道，對20μmol/L ATO作用于肝癌HepG2細胞株后不同時間段的RNA m6A的甲基化水平及調控蛋白水平綜合比較，結果隨著處理時間延長，HepG2的細胞存活率呈顯著下降趨勢（P＜0.05），而HepG2細胞的RNA m6A甲基化水平呈顯著上升趨勢（P＜0.05），但是在ATO處理后24 h和48 h的HepG2細胞存活率及RNA m6A甲基化水平變化不顯著，此結果初步證實20μmol/L ATO處理后6～24 h可顯著降低HepG2細胞存活率及RNA m6A甲基化水平，但是當處理時間影響不顯著。在20μmol/L ATO水平下，隨著處理時間增加，HepG2細胞中METTL3、METTL14、FTO及YTHDF1的相對表達量呈上升趨勢，而Cdc42的相對表達量呈下降趨勢，此結果進一步證實HepG2甲基化水平與HepG2的凋亡呈對立走勢；METTL3和FTO在ATO處理的12～48 h的相對表達量均顯著高于0 h（均P＜0.05），METTL14和YTHDF1在ATO處理的6～48 h的相對表達量均顯著高于0 h（均P＜0.05），Cdc42在ATO處理的6～48 h的相對表達量均顯著低于0 h（均P＜0.05），此結果證實METTL14、YTHDF1及Cdc42表達水平變化對ATO抑制HepG2細胞增殖療效的判定中起到早期參考價值。

綜上所述，ATO可顯著影響肝癌HepG2細胞RNAm6A的甲基化水平。在20μmol/LATO水平下，隨著ATO作用時間增加，HepG2細胞存活率顯著下降，其中m6A調控酶METTL14、YTHDF1及遷移蛋白Cdc42的早期表達水平變化顯著，這些指標對ATO抑制肝癌早期療效評定具有指導意義。

利益沖突：作者已申明文章無相關利益沖突。