白芍總苷對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的作用研究

易良波，楊菲菲，易忠祿

（1.赤峰學院附屬醫院，內蒙古 赤峰 024000；2.紅山區西城辦事處西南地村衛生室，內蒙古 赤峰 024000）

胰腺癌（pancreatic cancer，PC）是一種侵襲性高、惡性程度高的消化道腫瘤，早期癥狀隱匿，確診時多為中晚期，且預后較差。目前針對胰腺癌的手術、放療、化療及對癥支持治療等治療方法效果均不理想[1-2]。因此尋求新的治療藥物是目前胰腺癌相關研究的熱點。

白芍總苷（total glucosides of paeony，TGP）是從白芍根中提取的有效成分，具有抗炎、抗氧化、肝保護和免疫調節等作用，已被用于治療類風濕關節炎[3-4]。近年來關于白芍總苷抗腫瘤的研究顯示，白芍總苷對前列腺癌細胞、胃癌細胞、肝癌細胞增殖、遷移和侵襲具有抑制作用[5-7]，但目前關于白芍總苷對人胰腺癌的研究較少，且相關的機制還值得進一步探究。本研究旨在探討白芍總苷對人胰腺癌細胞ASPC-1增殖、遷移和侵襲的影響，以期為臨床治療胰腺癌提供實驗依據。

1 材 料

1.1 細胞 人胰腺癌細胞ASPC-1細胞系，貨號：SUER0463（XR），購于上海素爾生物科技有限公司。

1.2 藥物與試劑 白芍總苷膠囊（寧波立華制藥有限公司，批號：091102）；RPMI-1640（貨號：12633012）、胎牛血清（貨號：16140071）（美國Gibco公司）；CCK8細胞增殖檢測試劑盒（貨號：E606335）、Trizol（貨號：B511311）、一步法反轉錄熒光定量試劑盒（貨號：B639277）、結晶紫（貨號：A600331）（上海生工生物公司）；兔抗人PCNA單克隆抗體（貨號：ab92552）、兔抗人MMP-2單克隆抗體（貨號：ab92536）、兔抗人MMP-9單克隆抗體（貨號：ab76003）、兔抗人β-actin單克隆抗體（貨號：ab115777）、山羊抗兔IgG H&L（HRP）（貨號：ab6721）[艾博抗（上海）貿易有限公司]。

2 方 法

2.1 細胞培養 人胰腺癌細胞ASPC-1在含有1%鏈霉素（100 mg/mL）、青霉素（10 000 U/mL）和10%胎牛血清的RPMI-1640培養液中于37℃、5%CO2的培養箱中常規培養。

2.2 白芍總苷溶液的制備 白芍總苷膠囊用二甲基亞砜（DMSO）溶解分別配制成質量濃度為6.25、12.5、25、50、100、150、200、300、400μg/mL的溶液。

2.3 CCK8實驗檢測細胞毒性 取對數生長期ASPC-1細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化對數生長期細胞，細胞計數以5000個/孔接種于96孔板中，總體積為100μL，實驗組分別加入白芍總苷終質量濃度為0、6.25、12.5、25、50、100、150、200、300、400μg/mL的溶液，每組設置3個復孔，培養24h后，棄培養基，每孔加入20μL CCK8溶液，孵育4 h后，波長為450 nm下測定吸光度OD值。

2.4 CCK8實驗檢測細胞增殖 取對數生長期ASPC-1細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化對數生長期細胞，細胞計數以3000個/孔接種于96孔板中，總體積為100μL，實驗設空白對照組、白芍總苷低劑量組、白芍總苷中劑量組、白芍總苷高劑量組，分別加入終質量濃度為0、25、50、100μg/mL的白芍總苷溶液，每組設置3個復孔，分別培養24、48、72 h后棄培養基，每孔加入20μL CCK8溶液，孵育4 h后，波長為450 nm下測定吸光度OD值。

2.5 平板克隆實驗檢測細胞增殖 將對數生長期ASPC-1細胞，以500個/孔接種于6孔培養板中。組別和復孔的設置如方法“2.4”，培養48 h，觀察細胞克隆形成的數量，拍照并計數。實驗重復3次。

2.6 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移 取對數生長期ASPC-1細胞加入孔板中，每孔背后含有5條橫線并含有5×105個細胞。過夜培養后，用200μL的槍頭垂直于背后的橫線劃痕，洗去劃下的細胞。組別和復孔的設置如方法“2.4”，培養24 h后，取樣拍照。實驗重復3次。

2.7 Transwell小室實驗檢測細胞侵襲 在下室加500μL RPMI-1640（15%小牛血清）培養基和50μL不同濃度白芍總苷溶液，上室加入2 000個ASPC-1細胞懸液。組別和復孔的設置如方法“2.4”，在培養箱孵育48 h后，取出Transwell小室。清除未遷移上室細胞，用0.1%結晶紫浸染遷移至下室細胞。顯微鏡觀察細胞并拍照。實驗重復3次。

2.8 RT-qPCR檢測MMP-9、MMP-2、PCNA的mRNA表達水平 按密度5×105個/孔將對數生長期的ASPC-1細胞均勻鋪在6孔板中，組別和復孔的設置如方法“2.4”。培養48 h后，分別加入TRIzol提取RNA，再參照一步法反轉錄熒光定量試劑盒檢測MMP-9、MMP-2、PCNA的mRNA表達情況，以GAPDH作為內參。用Beacon Designer 8軟件設計特異性的引物。（見表1）RT-qPCR反應體系：2×onestep RT-qPCR Master Mix 10μL、正向引物（10μmol/L）0.4μL、反向引物（10μmol/L）0.4μL、RT enzyme Mix 0.65μL、RNA Template 1 ng、RNase free ddH2O至20μL。RT-qPCR反應程序：第一步，反轉錄50°C 5 min，1個循環；第二步，95℃預變性3 min，1個循環。第三步95℃變性10 s，退火/延伸/采集熒光信號60℃30 s，40個循環。RT-qPCR儀自動生成熔解曲線。每個樣品進行3次重復，2-△△Ct的方法進行相對定量分析。

表1 RT-PCR引物信息

2.9 Western blotting檢測MMP-2、MMP-9蛋白表達情況 按密度5×105個/孔將對數生長期的ASPC-1細胞均勻鋪在6孔板中，組別和復孔的設置如方法“2.4”。培養48 h后，用RIPA裂解液冰上裂解20 min，4℃、13 000 r/min離心20 min，收集上清，采用BCA試劑盒蛋白定量。取30～40μg總蛋白進行SDS-PAGE，轉膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗（1:1 000～1:10 000）4℃過夜，再加入二抗（1:10 000）室溫孵育1 h。最后用ECL曝光成像，凝膠成像系統分析結果。實驗重復3次。

2.10 統計學方法 所有的數據均采用SPSS 25.0軟件進行分析。計量資料采用（±s）表示，符合正態分布的計量資料，多組比較采用單因素方差分析，P〈0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 白芍總苷細胞毒性檢測CCK8結果表明，當白芍總苷質量濃度大于100μg/mL時，ASPC-1細胞的存活率明顯降低，表明白芍總苷濃度對ASPC-1細胞存活影響較大，因此選擇25、50、100μg/mL這3個濃度進行后續實驗。（見圖1）

圖1 不同濃度白芍總苷對ASPC-1細胞存活率的影響（±s，n=3）

3.2 白芍總苷對ASPC-1細胞增殖的影響C CK8結果表明，24 h白芍總苷中、高劑量組細胞增殖水平低于空白對照組（P〈0.05），白芍總苷低劑量組細胞增殖水平與空白對照組比較，差異無統計學意義（P〉0.05）；48、72 h白芍總苷低、中、高劑量組細胞增殖水平均低于空白對照組（P〈0.05），且白芍總苷濃度越高，細胞增殖速度下降越明顯。（見圖2）

圖2 各組ASPC-1細胞OD450值比較（±s，n=3）

Western blotting和RT-qPCR結果顯示，白芍總苷低、中、高劑量組ASPC-1細胞PCNA蛋白和PCNA mRNA表達水平均低于空白對照組（P〈0.05），且呈劑量依賴性。（見圖3）

圖3 各組ASPC-1細胞PCNA蛋白和PCNA mRNA表達水平比較

3.3 白芍總苷對ASPC-1細胞克隆形成能力的影響ASPC-1細胞給予白芍總苷干預后，白芍總苷低、中、高劑量組細胞克隆數均低于空白對照組（P〈0.05），且呈劑量依賴性。（見圖4）

圖4 白芍總苷對ASPC-1細胞克隆形成能力的影響

3.4 白芍總苷對ASPC-1細胞遷移和侵襲的影響 細胞劃痕實驗結果顯示，白芍總苷低、中、高劑量組細胞劃痕寬度明顯寬于空白對照組（P〈0.05）。（見圖5）細胞侵襲實驗結果顯示，白芍總苷低、中、高劑量組細胞穿過基膜的數量明顯少于空白對照組（P〈0.05）。（見圖6）

圖5 各組ASPC-1細胞遷移能力比較

圖6 各組ASPC-1細胞侵襲能力比較

3.5 白芍總苷對ASPC-1細胞MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA表達的影響 白芍總苷低、中、高劑量組細胞MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA表達水平均明顯低于空白對照組（P〈0.05），且呈劑量依賴性。（見圖7）

圖7 各組ASPC-1細胞MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA表達比較

4 討 論

白芍總苷（TGP）是一種潛在的抑癌劑。李湛全等[7]研究表明，白芍總苷聯合天冬酰胺酶對人肝癌HepG2細胞、胃癌SGC-7901細胞和胃癌AGS細胞的增殖具有協同抑制作用。在前列腺癌中，白芍總苷可通過抑制炎癥相關STAT3信號通路激活抑制癌細胞的增殖、遷移和侵襲[5]。此外，白芍總苷還可通過降低B細胞活化因子（BAFF）對n-亞硝基二乙胺（DEN）誘導的大鼠肝細胞癌具有抑制作用[6]。

本研究結果顯示，不同濃度的白芍總苷能夠降低胰腺癌細胞系ASPC-1的細胞活力，且呈劑量依賴性。同時，當白芍總苷質量濃度大于100μg/mL時，ASPC-1細胞的細胞存活率明顯降低，因此，選擇25、50、100μg/mL這3個質量濃度對胰腺癌細胞系ASPC-1進行后續實驗。白芍總苷處理后，ASPC-1細胞的增殖活力降低，且遷移和侵襲能力下降。表明白芍總苷可抑制胰腺癌細胞系ASPC-1的增殖、遷移和侵襲。

腫瘤的形成是多因素、多階段、多基因變異所致的復雜病變過程。已有的研究表明，細胞增殖失控是導致細胞癌變的重要機制之一。增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA），又被稱為周期素，位于人類第20號染色體，具有調控DNA合成步驟、修復損傷DNA、輔助DNA聚合酶δ與DNA鏈結合、調控細胞周期等作用[8-9]。KHAN S等[10]研究表明，奧美昔芬納米顆粒通過抑制PCNA的表達來抑制胰腺腫瘤的生長。而SOHN E J等[11]研究表明，在胰腺癌中CCR4-NOT轉錄復合體亞基2（CNOT2）能上調PCNA表達促進腫瘤生長。由此可知，PCNA的表達水平與胰腺癌增殖狀態呈正相關，能夠準確反映胰腺癌細胞增殖狀態。本研究表明，經白芍總苷處理后，ASPC-1細胞中PCNA mRNA和PCNA蛋白表達水平均降低，提示白芍總苷能通過下調PCNA的表達來抑制胰腺癌細胞的增殖。這與上述結論一致。

侵襲和轉移是惡性腫瘤最基本的生物特征之一，也是引起癌癥患者死亡的根本原因?；|金屬蛋白酶（matrix metallo proteinases，MMPs）是目前研究發現與侵襲轉移有關酶最重要的一類[12-13]。本研究表明，經白芍總苷處理后，ASPC-1細胞中MMP-2、MMP-9蛋白和mRNA表達水平均降低，提示白芍總苷可以抑制MMP-2、MMP-9的表達。這與NAVEED等[14]研究結果一致，他們指出白芍總苷能抑制MMP-2、MMP-9的表達減輕小鼠心肌梗死后心肌重構。MMP-2、MMP-9是MMPs家族中的重要成員，能通過降解細胞外基質，導致腫瘤細胞侵襲轉移。目前已有研究表明MMP-2和MMP-9在胰腺癌中高表達，且表達水平與胰腺癌臨床分期、組織學分化、是否有淋巴結轉移及腫瘤直徑有關，下調MMP-9和MMP-2的表達可以抑制胰腺癌細胞侵襲轉移的能力[15-17]。由此我們可以推測，白芍總苷能通過下調MMP-2、MMP-9的表達來抑制胰腺癌細胞侵襲轉移的能力。

綜上所述，本研究在分子和細胞層面揭示了白芍總苷抗胰腺癌的作用機制，為胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲提供體外實驗證據。并為進一步尋找高效、低毒的抗腫瘤藥物奠定了基礎，值得進行深入研究。