槲皮素對脂多糖誘導的NRK-52E細胞凋亡和線粒體功能的作用研究*

王惠麗，鄧文喻，劉 艷，穆小萍，陳志江

（1.廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 511442；2.南方醫科大學珠江醫院，廣東 廣州 510280）

膿毒癥急性腎損傷（sepsis associated acute kidney injury，S-AKI）是膿毒癥患者常見的嚴重并發癥，約有50%膿毒癥患者合并急性腎功能損傷，而且合并腎損傷的患者病死率高，總體死亡率高達60%[1-2]。線粒體功能障礙是S-AKI的重要病理生理機制之一，在大鼠膿毒癥腎損傷模型中發現線粒體損傷后出現氧利用障礙，即使在微循環改善后氧輸送和氧供恢復接近正常后仍存在氧利用障礙，即線粒體呼吸窘迫（mitochondrial distress syndrome，MDS），提示線粒體是膿毒癥時器官損傷的主要靶細胞器[3-5]。線粒體不僅是細胞的能量中心，更為重要的是可組成的一個可塑性細胞器網絡，共同維持著多種細胞功能和過程，如活性氧水平、胞漿鈣平衡和細胞凋亡，這些病理生理過程都與膿毒癥器官損傷密切相關[6-7]。因此以線粒體功能為靶點，探索S-AKI潛在藥物的作用機制，具有現實意義。

槲皮素（quercetin）是一種常見的黃酮類化合物，在蔬菜、水果、紅酒及一些谷類中均可存在，是人類飲食中最主要的生物類黃酮，而且多種藥用植物中均含有此成分。槲皮素有廣泛的藥理學作用，如抗氧化、抗炎、抗纖維化、抗病毒、逆轉耐藥性等[8-10]。近年來發現槲皮素通過作用于線粒體生物發生、線粒體自噬參與線粒體功能調控，對線粒體電子傳遞鏈和ATP生成產生影響，進而影響線粒體膜電位變化，抑制線粒體誘導內源性凋亡[11-13]。目前槲皮素與膿毒癥介導腎損傷的線粒體功能調控機制尚不明確。本研究擬通過建立S-AKI細胞模型，探索槲皮素對S-AKI線粒體功能和細胞凋亡的作用靶點與保護機制，為闡明槲皮素的腎保護作用提供實驗依據。

1 試劑與儀器

1.1 實驗材料 大鼠腎小管上皮細胞NRK-52E購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫；胎牛血清（美國Gibco公司，貨號：16000044）；DMEM培養基（美國Gibco公司，貨號：41966-052）；胰蛋白酶（美國Gibco公司，貨號：25200-056）；噻唑藍（上海麥克林生化科技有限公司，貨號：298-93-1）；槲皮素（上海麥克林生化科技有限公司，貨號：117-39-5）；脂多糖（LPS）（美國Sigma-Aldrich，貨號：L2880）；DCFH-DA（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：S0033S）；線粒體膜電位試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：C2006）；ATP檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：S0026）；BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：P0010S）；BeyoECL Plus發光液（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：P0018S）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技術有限公司，貨號：P0013B）；MitoROSTM580試劑盒（美國AAT Bioquest公司，貨號：16052）；BAX抗體（Proteintech公司，貨號：50599-2-Ig）；BCL-2抗體（Proteintech公司，貨號：26593-1-AP）；GAPDH抗體（Proteintech公司，貨號：60004-1-Ig）；Gluta電鏡固定液（北京索萊寶科技有限公司，貨號：P1126）。

1.2 主要儀器 電泳儀（美國BIO-RAD公司）；離心機（美國Thermo公司）；激光共聚焦（奧林巴斯公司，Fv10i）；熒光酶標儀（CLARIOstar Plus公司）；熒光顯微鏡觀察（奧林巴斯公司，貨號：BX63）；透射電鏡（日立H-7500）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養NRK-52E細胞培養條件為：含10%胎牛血清DMEM培養基中，培養箱溫度為37℃，培養箱內CO2體積分數為5%，溫度為37℃，飽和濕度為95%。約2～3 d傳代1次，取對數生長期的NRK-52E細胞進行實驗。細胞分組共分3組:（1）對照組：以正常培養液培養；（2）LPS組：LPS 50μg/mL處理12 h；（3）LPS+槲皮素組：25μmol/L槲皮素孵育24 h后，加入LPS處理12 h。

2.2 MTT檢測細胞活力 細胞接種于96孔板，細胞密度1×104/L，每孔200μL培養液，細胞融合度達60%～70%，按實驗條件給予不同處理后，在生物安全柜中避光加入MTT溶液（5 mg/mL），每孔加20μL。將96孔板繼續放在培養箱培養4 h，用注射器小心吸棄孔內培養液，每孔加入150μL DMSO，室溫避光條件下水平搖床上緩慢搖動10 min。用多功能酶聯免疫檢測儀檢測490 nm處波長的吸光度值，結果取6個復孔的平均值，此實驗重復3次。細胞存活率=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）。

2.3 DCFH-A探針檢測細胞總活性氧（ROS）取對數生長期NRK-52E細胞，調整細胞濃度為1×105/mL接種于6孔板中，待細胞融合度達60%～70%，按實驗分組處理細胞后吸去培養上清，無血清培養基洗滌細胞兩次后，加入終濃度為10μmol/L的1∶1 000無血清稀釋的DCFH-DA，37℃細胞培養箱內孵育20 min，用無血清細胞培養液洗滌細胞3次，充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。熒光顯微鏡下觀察ROS的強度，使用熒光酶標儀（激發波長488 nm，最大發射波長525 nm）對各組的ROS進行半定量分析。

2.4 MitoROS探針檢測線粒體（mtROS）將細胞接種于六孔板并按分組處理后無血清培養基洗滌2次，制備1×MitoROSTM580試劑工作溶液避光在細胞培養箱孵育30 min，孵育后吸去MitoROSTM580工作液，用HBSS緩沖液輕輕洗滌細胞3次。熒光顯微鏡觀察mtROS的強度，使用熒光酶標儀（激發波長540nm，最大發射波長590 nm）對各組的ROS進行半定量分析。

2.5 線粒體膜電位檢測 將細胞接種于共聚焦培養皿，按前述方法分組處理細胞后，吸去細胞培養液，PBS輕輕洗滌細胞2次，分別加入1 mL JC-1染色工作液后，細胞培養箱里孵育20 min，孵育結束后吸除上清，用JC-1 Buffer洗滌2次，加入無血清細胞培養液，在激光共聚焦顯微鏡下觀察線粒體膜電位變化。

2.6 細胞ATP水平檢測 按實驗分組處理細胞后，吸去培養液，用預冷的PBS洗滌3次，按照說明書使用裂解液裂解細胞，然后4℃條件下離心10 min，取上清；按試劑說明書配制ATP檢測試劑后加入裂解上清液，接著室溫條件下放置5min，用移液槍吹打混勻，間隔2 s后用熒光酶標儀檢測并計算樣品ATP的濃度，同時檢測各組樣品的細胞蛋白濃度，最后進行單位換算并記錄最終結果。

2.7 透射電鏡觀察細胞線粒體形態 按實驗分組處理細胞后，吸去培養液，用預冷的PBS洗滌3次，加入無血清培養基用細胞刮刀將細胞從培養基皿底部刮下來，放到離心管中，以800 r/min離心3 min，棄上清，加Gluta電鏡固定液固定處理組細胞，放置于4℃冰箱固定18～24 h后，經1%鋨酸固定后，乙醇、丙酮脫水置換，Epon812包埋劑包埋后在超薄切片機下把包埋塊切成1μm切片染色后在透射電鏡下觀察線粒體結構形態。

2.8 免疫印跡法檢查細胞凋亡相關蛋白 分組處理好的細胞用PBS輕輕洗滌后，用細胞裂解液裂解細胞，BCA試劑盒提取總蛋白并檢測各組蛋白濃度。加入Loading Buffer并煮沸保存，SDS-PAGE電泳，選擇10%分離膠和5%濃縮膠進行蛋白電泳，待電泳完畢后，選取目的蛋白分子量區域凝膠進行轉膜，轉至PVDF膜后用5%脫脂牛奶封閉1h，搖床孵育一抗4℃過夜，TBST洗滌后室溫下孵育二抗1 h，TBST洗滌后，用ECL化學發光法進行發光。

2.9 統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析。結果采用“均數±標準差”表示，多組間比較使用單因素方差分析。滿足方差齊，兩兩比較用LSD法；如果方差不齊，結果用Welch法進行校正，多組間的兩兩比較用Dunnett’s T3法。P〈0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 槲皮素對LPS誘導的NRK-52E細胞活力的影響MTT檢測5、10、15、25、50、75、100μmol/L槲皮素對腎小管上皮細胞細胞活力的影響，如圖1A所示，在5～25μmol/L的濃度時細胞活力與對照相比較，差異無統計學意義（P〉0.05），后續槲皮素實驗處理濃度采用25μmol/L進行。如圖1B所示，LPS刺激能導致NRK-52E細胞活力下降，而槲皮素預處理后，能降低LPS所導致的細胞活力下降，差異均有統計學意義（P〈0.05）。

圖1 槲皮素對NRK-52E和LPS誘導的NRK-52E細胞活力的影響（±s）

3.2 DCFH-DA、MitoROSTM580熒光探針檢測各組NRK-52E細胞ROS、mtROS水平 如圖2A、B所示，DCFH-DA探針裝載后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光越強提示細胞內ROS水平越高，LPS處理后細胞熒光強度顯著增高，LPS+槲皮素組細胞熒光強度較LPS組低；MitoROSTM580探針裝載后，熒光顯微鏡下觀察紅色熒光越強提示細胞內mtROS水平越高，LPS處理后細胞紅色熒光強度顯著增高，LPS+槲皮素組細胞熒光強度較LPS組低。對各組細胞ROS、mtROS水平進行定量分析結果顯示LPS組ROS、mtROS水平顯著高于對照組和LPS+槲皮素組（P〈0.05）。（見圖2C、D）

圖2 槲皮素對NRK-52E細胞ROS、mtROS及LPS誘導的NRK-52E細胞的影響

3.3 槲皮素對LPS誘導NRK-52E細胞線粒體膜電位的影響 線粒體膜電位是反應線粒體功能正常與否的重要指標之一，JC-1染色后，線粒體膜電位正常會顯示紅色熒光，反之線粒體膜電位異常會顯示綠色熒光。共聚焦顯微鏡下觀察LPS組NRK-52E細胞線粒體膜電位明顯下降，LPS+槲皮素組與LPS組比較，線粒體膜電位有所恢復。（見圖3）

圖3 槲皮素對LPS誘導NRK-52E細胞線粒體膜電位的影響

3.4 槲皮素對LPS誘導NRK-52E細胞ATP水平影響LPS組、LPS+槲皮素組細胞ATP含量均明顯低于對照組（P〈0．05）；LPS+槲皮素組細胞ATP含量明顯高于LPS組，差異有統計學意義（P〈0．05）。（見圖4）

圖4 槲皮素對LPS誘導NRK-52E細胞ATP水平影響

3.5 透射電鏡觀察各組細胞線粒體超微結構變化 電鏡結果顯示對照組NRK-52E細胞線粒體密度分布均勻，線粒體邊界清楚、基質和嵴結構正常。LPS組可見線粒體密度減少、線粒體出現腫脹明顯、邊界不清、基質密度降低、嵴脫落、空泡樣變，可見部分線粒體溶解現象。與LPS組比較，槲皮素+LPS組NRK-52E細胞線粒體損傷現象減輕，表現為線粒體密度稍增多、腫脹減輕，未見空泡樣變和溶解情況。

圖5 透射電鏡觀察各組細胞線粒體超微結構變化

3.6 槲皮素對LPS誘導的NRK-52E細胞凋亡相關蛋白的影響 與對照組比較，LPS組Bax蛋白表達水平明顯升高，Bcl-2蛋白表達水平明顯降低，差異均有統計學意義（P〈0．05）。與LPS組比較，LPS+槲皮素組Bax蛋白表達明顯降低，Bcl-2的表達明顯升高（P〈0．05）。（見圖6）

圖6 槲皮素對LPS誘導的NRK-52E細胞凋亡相關蛋白Bax、Bcl-2的影響

4 討 論

膿毒癥定義更新為感染引起的炎癥反應失調導致危及生命的器官功能障礙[14-15]。器官功能障礙是膿毒癥進展的核心，腎臟是膿毒癥易受損的靶器官。膿毒癥是急性腎損傷的最常見原因，占到所有病例的50%左右[1-2]。膿毒癥急性腎損傷往往是危重癥患者多器官功能障礙綜合征（MODS）的一部分，死亡率高達60%以上，另外其可增加后期出現慢性腎臟病的風險[1-2]。腎臟是機體內線粒體含量第二豐富的器官，僅次于心臟，每天大約消耗機體7%的能量，線粒體的結構和功能正常對于維持腎臟功能代謝至關重要[16-17]。在經典的LPS和盲腸結扎穿孔（CLP）膿毒癥模型中已經證實線粒體功能出現明顯結構上損傷和功能障礙，出現線粒體腫脹、基質透明、線粒體嵴斷裂、線粒體膜電位下降。線粒體是細胞內重要的亞細胞器，是細胞內的能量中心，同時參與鈣穩態、ROS生成，以及炎癥和凋亡信號途徑，共同維持著多種細胞功能和過程。在膿毒癥時，失控的炎癥反應導致包括TNF-α、IL-1β和IL-6在內大量細胞因子產生，進而導致抑制氧化磷酸化、ROS生成增加[18-19]。此外氧化應激會影響電子傳遞鏈受阻礙、膜電位崩潰、線粒體通透性開放，這些變化結果是線粒體功能障礙、結構損傷，線粒體內組分（mtDNA、細胞色素c）釋放到胞漿進一步激活凋亡和炎癥通路[20-21]。線粒體功能障礙介導了急性腎功能損害的發生進展，因此，進一步了解通過改善線粒體作為靶點研究具有探索價值。

近年來發現槲皮素能參與線粒體功能調控，可對線粒體電子傳遞鏈和ATP生成產生影響，進而影響線粒體膜電位變化，抑制線粒體誘導內源性凋亡[11-13]。研究發現LPS能導致NRK-52E細胞活力下降，導致線粒體功能和結構的損傷，凋亡通路信號通路的激活，槲皮素能夠明顯抑制LPS誘導的細胞ROS和mtROS的產生、線粒體膜電位的下降、ATP下降，同時電鏡下觀察到線粒體結構損傷減輕，抑制凋亡信號通路的活化。

槲皮素對線粒體功能的調控可能與線粒體質量控制有關。線粒體質量控制（Mitochondrial quality control，MQC）是指線粒體網絡受到復雜的細胞內和細胞外信號通路的密切調控，維持線粒體穩定的重要機制，體現在對線粒體形態、遷移、分布、數量等方面的調控[22-23]。線粒體質量控制主要通過一些相互關聯又相互制約的途徑來進行質量維持，其中包括正常蛋白的生成與異常蛋白的及時降解、新舊線粒體的更替及線粒體DNA的正常合成與修復的維持等，主要涉及以下3種機制：線粒體生物發生（Mitochondrial biogenesis）、線粒體分裂與融合（Mitochondrial fission and fusion）、線粒體自噬（Mitophagy）。研究發現槲皮素能夠參與線粒體生物發生、線粒體自噬的調控。如LI X等[24]發現槲皮素可顯著減少TBI誘導的神經元凋亡，改善線粒體損傷，顯著地加速了PGC-1a蛋白從細胞質到細胞核，提示槲皮素能通過介導PGC-1a通路增加線粒體生物發生的活性來減輕TBI模型的腦損傷。關于槲皮素對線粒體自噬調控，LIU P Y等[25]發現槲皮素通過增加LC3I、Pink1、Beclin1表達來阻斷高脂飲食對線粒體自噬的抑制作用，槲皮素還能促進線粒體自噬關鍵蛋白-Parkin易位到線粒體。

綜上所述，槲皮素能夠減輕LPS所誘導的腎小管上皮細胞損傷，與恢復線粒體功能、緩解線粒體結構損害、抑制凋亡通路活化有關，為研究槲皮素防治S-AKI提供了實驗基礎，槲皮素的保護作用可能與線粒體質量控制調控機制有關，還有待于進一步研究。