HPLC波長切換法同時測定復(fù)方當歸注射液中4種有效成分的含量

周 穎，譚春梅，昝 珂，姚 瑤，鄭 成

（1.浙江省食品藥品檢驗研究院/國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室，浙江 杭州 310052；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

復(fù)方當歸注射液由當歸、川芎、紅花3味中藥組成，有活血通絡(luò)、祛瘀止痛之效，常用于治療痛經(jīng)、閉經(jīng)、風(fēng)濕痹痛及中風(fēng)后遺癥等[1]。臨床上主要用于治療各種瘀血證和心血管疾病等[2-3]。現(xiàn)收載于《衛(wèi)生部藥品標準》中藥成方制劑第二十冊，采用薄層掃描法測定阿魏酸的含量，操作較為煩瑣，難以全面控制其質(zhì)量。因此對復(fù)方當歸注射液進行全面地質(zhì)量控制顯得尤為重要。

目前，關(guān)于復(fù)方當歸注射液的質(zhì)量控制研究已有一些相關(guān)報道[4-9]。有研究[10-15]建立高效液相色譜法測定了阿魏酸的含量。魏春芬[16]及彭紅等[17]建立高效液相色譜法同時測定了羥基紅花黃色素A和阿魏酸的含量。為進一步提高復(fù)方當歸注射液的質(zhì)量控制水平，本實驗采用HPLC-DAD波長切換技術(shù)同時測定4個活性成分的含量，使4種成分在各自的最大吸收波長下進行含量分析，提高了檢測靈敏度，實現(xiàn)了復(fù)方當歸注射液中多指標、多成分的質(zhì)量評價，以期為復(fù)方當歸注射液質(zhì)量評價方法的制定提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 藥物與試劑 復(fù)方當歸注射液（某藥業(yè)有限公司；批號：1810191，1911141，2003202）；羥基紅花黃色素A（批號：111637-201810，純度93.1%）、綠原酸（批號：110753-201817，純度96.8%）、咖啡酸（批號：111885-201703，純度99.7%）、阿魏酸（批號：110773-201614，純度99.0%）（中國食品藥品檢定研究院）；甲醇、磷酸（分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；實驗用水為超純水。

1.2 主要儀器Ultimate3000超高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher公司，包括Chromeleon 7.2 SR5色譜工作站，SRD-3600真空在線脫氣機，DGP-360雙三元梯度泵，WPS-3000TRS自動進樣儀，TCC-3000R柱溫箱，DAD-3000RS二極管陣列檢測器，VWD-3400RS可變波長檢測器）；XPE-2015電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；Milli PAK advantage A10自動純水機（美國Milipore公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Symmetry Shield RP18柱（4.6 mm×250 mm，5μm），流動相：甲醇-0.1%磷酸水溶液（28∶72，V/V）；流速：0.8 mL/min，柱溫：30℃，檢測波長：0～16 min，327 nm；16～22.5 min，323 nm；22.5～30 min，403 nm；30～35 min，316 nm，進樣量：10μL。

2.2 對照品溶液的配制 分別精密稱取羥基紅花黃色素A、綠原酸、阿魏酸和咖啡酸對照品適量，加50%甲醇制成1 mL含羥基紅花黃色素A、綠原酸、阿魏酸、咖啡酸分別為425.28、184.60、365.90、388.43μg的溶液，作為對照品儲備液。分別精密量取上述對照品儲備液適量，加50%甲醇制成1 mL含羥基紅花黃色素A、綠原酸、阿魏酸和咖啡酸分別為212.64、18.46、36.59、38.84μg的溶液，搖勻，作為混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取供試品10支，混合均勻，用0.45μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗 精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各10μL，并按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示羥基紅花黃色素A、綠原酸、阿魏酸和咖啡酸4個色譜峰的分離度均良好，表明所建立的色譜方法滿足測試要求。（見圖1）

圖1 HPLC色譜圖

2.5 線性關(guān)系考察 取“2.2”項下混合對照品溶液，采用逐步稀釋的方法制成一系列不同濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，以待測物的峰面積為縱坐標、對照品濃度為橫坐標進行線性回歸，得標準曲線方程。結(jié)果表明在給定的濃度范圍內(nèi)，各化合物的響應(yīng)值與濃度間均呈良好的線性關(guān)系。（見表1）

表1 4種成分線性關(guān)系

2.6 精密度試驗 取混合對照品溶液10μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，結(jié)果綠原酸、咖啡酸、羥基紅花黃色素A和阿魏酸色譜峰峰面積的RSD分別為0.25%、0.12%、0.38%和0.15%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗 取復(fù)方當歸注射液（批號：2003202），分別在1、2、4、6、10、15、20 h進樣，測定各指標成分峰面積，計算RSD，結(jié)果綠原酸、咖啡酸、羥基紅花黃色素A和阿魏酸色譜峰峰面積RSD分別為1.50%、1.89%、0.63%和0.33%，表明復(fù)方當歸注射液在20 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗 取復(fù)方當歸注射液（批號：2003202），按“2.3”項方法操作，平行制備供試品溶液6份，分別測定，計算得出每1 mL樣品含綠原酸、咖啡酸、羥基紅花黃色素A和阿魏酸分別為26.75、15.58、80.01和37.53μg，其RSD分別為0.64%、1.29%、0.46%和0.47%，表明提取方法的重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗 精密量取3 mL已知含量的復(fù)方當歸注射液樣品（批號：2003202）6份，精密加入綠原酸、羥基紅花黃色素A和阿魏酸對照品儲備液各0.5 mL，咖啡酸儲備液稀釋5倍后精密加入0.5 mL制備供試品溶液并測定，計算回收率以考察方法準確性。結(jié)果綠原酸、咖啡酸、羥基紅花黃色素A和阿魏酸平均加樣回收率分別為99.44%、102.70%、104.12%和98.34%，RSD分別為0.39%、0.49%、0.21%和0.11%，說明方法的準確性良好。（見表2）

表2 加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.1 0樣品的測定 取3批復(fù)方當歸注射液，分別進樣10μL，并按“2.1”項下條件測定，計算各批樣品中化合物的含量。（見表3）

表3 3批樣品含量測定結(jié)果（±s，μg/mL）

表3 3批樣品含量測定結(jié)果（±s，μg/mL）

批號 綠原酸 咖啡酸 羥基紅花黃色素A阿魏酸2003202 26.80±0.02 15.77±0.06 80.26±0.01 37.63±0.02 1911141 22.95±0.01 13.19±0.17 70.57±0.01 31.03±0.02 1810191 20.06±0.02 14.21±0.04 58.34±0.02 28.34±0.03

3 討 論

3.1 波長的選擇 通過紫外全波長掃描羥基紅花黃色素A、綠原酸、阿魏酸和咖啡酸對照品以選擇波長。羥基紅花黃色素A、綠原酸、阿魏酸和咖啡酸4種待測成分的最大吸收波長分別為327、323、403、316 nm。為保證4種成分的最高檢測靈敏度，采用波長切換方法進行檢測，最終選擇在0～16.0 min，采用327 nm檢測綠原酸；在16.0～22.5 min，采用323 nm檢測咖啡酸；在22.5～30.0 min，采用403 nm檢測羥基紅花黃色素A；在30.0～50.0 min，采用316 nm檢測阿魏酸。

3.2 色譜條件的優(yōu)化 色譜柱了考察了Eclipse plus C18、Ultimate plus C18和Symmetry Shield RP18柱，結(jié)果表明Symmetry Shield RP18色譜柱可使復(fù)方當歸注射液中4種成分達到了較好的分離，而使用Eclipse plus C18和Ultimate plus C18時，樣品中綠原酸與雜質(zhì)峰無法達到有效的分離，故選擇Symmetry Shield RP18作為色譜柱。

本研究建立了波長切換技術(shù)同時測定復(fù)方當歸注射液中綠原酸、咖啡酸、羥基紅花黃色素A和阿魏酸含量的HPLCDAD方法，涵蓋發(fā)揮藥效的主要活性成分，該方法操作簡單、準確可靠、專屬性好、精密度高，可為復(fù)方當歸注射液質(zhì)量控制標準的制定提供參考。