紅花有效成分提取工藝研究*

立 新，郝俊生，巴德瑪斯仁，云 峰，奧·烏力吉

（1.內蒙古民族大學蒙醫藥學院，內蒙古 通遼 028000；2.內蒙古民族大學附屬醫院，內蒙古 通遼 028000；3.內蒙古蒙醫藥工程技術研究院，內蒙古 通遼 028000）

三臣丸是蒙醫臨床中常用的傳統古方，又稱臣方三味，最早記載于《四部醫典》[1]，主要用于治療小兒肺熱、肝熱等臟腑之熱證，以及呼吸道感染引起的感冒咳嗽、發燒等癥狀。其毒性小、療效確切，為治療各種熱證、特別是小兒退熱的首選藥[2-4]。三臣小兒退熱貼是由三臣丸的劑型改進而成的，由紅花、人工牛黃、天竺黃組成，其原劑型為水丸和散劑[5-6]。此兩種劑型均由于小兒服用不便、順從性差而影響其療效。本課題擬將其劑型改進為外用貼劑，以便克服傳統劑型的缺點，增加療效，減少毒副作用。新劑型三臣小兒退熱貼攜帶和使用方便，解決了兒童及嬰幼兒使用困難的難題。

羥基紅花黃色素A為紅花中含量較高的成分，也是其主要活性成分，為評價紅花的質量標準之一[5]，常用于紅花相關制劑質量標準的含量測定指標。目前提取紅花黃色素A工藝的報道很多，但不同文獻報道的提取方法各不相同。本實驗從中選擇最佳條件為當因素，采用正交試驗設計法，優選三臣小兒退熱貼中羥基紅花黃色素A最佳提取工藝，為有效利用紅花提供依據。

1 材 料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（華普科技有限公司）；數控超聲波洗清器（昆山超聲儀器有限公司）；恒溫水浴鍋（上海-恒科學儀器有限公司）；電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統有限公司）；冷凝回流裝置；電熱鼓風干燥器（上海-新苗醫療器械有限公司）。

1.2 試藥 紅花由內蒙古民族大學附屬醫院蒙藥制劑室提供（批號：20190714），經過全檢，符合《中華人民共和國藥典》（2015版）“紅花”項下相關規定。羥基紅花黃色素A（中國食品藥品檢驗所，批號：110876-202004）。

1.3 試劑 無水乙醇（分析純，天津大茂化學試劑廠，批號：20190905）；甲醇（色譜純，德國默克兩合公司）；乙腈（色譜純，德國默克兩合公司）；磷酸溶液（分析純，天津市永大化學試劑有限公司，批號：20170519）；超純水（自制）。

2 方法與結果

2.1 羥基紅花黃色素A的含量測定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；流動相：A相-乙腈，B相-0.7%磷酸溶液，梯度洗脫（0～15 min，A相12%，B相88%；15～30 min，A相12～32%，B相88%～68%）；流速：1.0 mL/min，檢測波長：403 nm；柱溫30℃；進樣量：10μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取羥基紅花黃色素A對照品1.32 mg，放置10 mL容量瓶中，加25%甲醇定容，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取紅花粉末（過50目篩）約4.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入15倍水，回流提取3次，60 min/次。合并提取液，定容至250 mL，0.45μm濾膜濾過，精密吸取25 mL，放置50 mL容量瓶中，加水定容即可。

2.1.4 專屬性和系統適用性 將對照品溶液與供試品溶液各進樣10μL，色譜圖見圖1～2。理論塔板數大于3 000，分離度1.82，專屬性良好。

圖1 對照品色譜圖

圖2 供試品色譜圖

2.1.5 標準曲線的繪制 取“2.1.2”項羥基紅花黃色素A對照品溶液2、5、10、15、18μL進樣6次，測定峰面積。以峰面積值（Y）對進樣質量（X）進行線性回歸，得回歸方程：Y=2 271.2X-86.936，R2=1.00，結果見圖3。羥基紅花黃色素A在0.264～2.376 mg范圍內線性關系良好。

圖3 標準曲線圖

2.2 方法學考察

2.2.1 精密度試驗 取“2.1.2”項羥基紅花黃色素A對照品溶液，重復進樣6次，每次10μL，記錄峰面積和保留時間，計算RSD值。結果峰面積RSD=0.85%（n=6），保留時間RSD為0.31%，表明儀器精密度良好。

2.2.2 穩定性試驗 將“2.1.3”項供試品溶液于0、2、4、6、8、12 h共進樣6次，每次10μL，記錄峰面積，計算RSD值。RSD為1.13%。表明供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.2.3 重復性試驗 取樣品6份，按“2.1.3”法制備后取10μL進樣，測定每份樣品中羥基紅花黃色素A的含量。RSD為1.75%。表明該方法重復性很好。

2.2.4 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品9份，分為低、中、高劑量3組。分別精密加入相當于待測樣品含量的50%、100%、150%的對照品溶液，按樣品測定項下操作。平均回收率為99.6%；RSD值為1.98%。表明該方法準確性良好。

2.3 紅花提取工藝的優選

2.3.1 因素水平表 根據文獻研究結果[6-8]，以溶劑、溶劑量、提取時間、提取次數為影響因素，每個因素設計3個水平，建立L9（34）試驗表。（見表1）

表1 因素水平表

2.3.2 正交試驗結果 精密稱取4.0 g紅花粉末（過50目篩），按正交試驗表進行提取，合并提取液，定容至250 mL。搖勻，精密吸取25 mL，加相應溶劑定容至50 mL，每次進樣10μL，測定羥基紅花色黃素A的含量。由于羥基紅花黃色素A在高溫下穩定性差[9]。所以提取溫度和時間不宜過高、過長。

精密吸取提取液200 mL，置于恒重的蒸發皿中，在水浴鍋上蒸干后移到105℃烘干箱中放置3 h，取出置干燥器中，放冷30 min，測定出膏量。

以羥基紅花黃色素A含量和出膏量為指標，采用加權綜合評分優選最佳提取工藝，并對加權分析的結果進行方差分析。綜合評價分數=提取率×60%+出膏率×40%。結果見表2。

表2 正交試驗結果

由正交試驗結果可知各因素對羥基紅花黃色素A的提取效果的影響大小順序為：D〉A〉C〉B，即提取次數〉提取溶劑〉提取時間〉溶劑量，三臣小兒退熱貼最佳提取工藝為A3B3C2D3。

由于溶劑量的影響最小，且15倍和20倍溶劑量之間無顯著差異，為了節省生產成本，最終確定紅花最佳提取工藝為15倍的60%乙醇為溶劑，回流提取3次，每次60 min。在此條件下，羥基紅花黃色素A提取率達98.9%。

2.3.3 方差分析 由直觀分析和方差分析可見，各因素對羥基紅花黃色素A的提取無顯著性差異，方差分析結果見表3。

表3 方差分析結果

3 討 論

三臣丸是蒙醫和藏醫通用的傳統古方，最早記載于《四部醫典》[10]，在很多蒙醫經典著作里均有記載。三臣丸為解熱散劑族“臣方”的主要部分或基礎方[11-14]。三臣丸主要用于治療小兒傷風感冒、肺炎、支氣管炎及其引起的咳嗽、發燒等癥狀。三臣丸治療各種熱證療效確切，為蒙醫臨床中最常用的小兒退熱的藥。本課題擬將其劑型改進為外用貼劑，為發熱兒童提供安全、有效、使用方便的經皮給藥蒙藥復方制劑。

三臣小兒退熱貼成型工藝為取處方量紅花，粉碎過50目篩，加15倍60%乙醇，回流提取3次，每次60 min，合并提取液，過濾，50℃減壓濃縮至浸膏，冷凍干燥，備用。人工牛黃和天竺黃，粉碎成細粉，過150目篩，備用。將N46和甘羥鋁加入盛有甘油的燒杯中，充分攪勻后加入處方量人工牛黃、天竺黃藥粉，用攪拌器混合均勻作為A相；將酒石酸溶解于純化水中，加入紅花提取物凍干粉攪拌使之完全溶解加入N500充分攪勻作為B相，再將B相加入A相中，攪拌充分交聯后，涂布于無紡布上，蓋上保護膜，即得三臣小兒退熱貼。

藥理實驗采用干酵母致大鼠發熱模型，對三臣小兒退熱貼紅花提取組、原藥粉組和原劑型組的藥效進行比較，結果顯示紅花提取組的療效優于原藥粉組，劑型改進后的三臣小兒退熱貼高、中劑量組退熱效果良好，與原劑型相當，發熱后4 h使體溫降至正常。

組方中人工牛黃主要成分為膽酸、膽紅素，以及無機鹽類和微量元素[15]；天竺黃主要成分為硅酸鹽及多種無機元素和氨基酸[15]。該兩種藥物均不宜提取。紅花的主要成分是紅花黃色素，屬于黃酮類成分中的查爾酮類，溶于水和乙醇[16]。紅花黃色素也溶于甲醇，但溶媒殘留對人體危害，且生產成本高、生產過程中對環境造成污染，綜合以上因素，本課題組設計了以水和不同濃度乙醇為溶劑并以羥基紅花黃色素A含量及出膏量為考察指標，運用正交試驗方法，確定了三臣小兒退熱貼最佳提取工藝。

最終確定羥基紅花黃色素A適宜的提取工藝條件為：以15倍量60%乙醇為溶劑，回流提取3次，每次60 min。該方法穩定可行，可用于三臣小兒退熱貼中羥基紅花黃色素A的提取。