伸筋草經(jīng)皮給藥對小鼠抗炎鎮(zhèn)痛作用及機制研究*

朱 杰，于立芹，張華南，范 毅，魏 磊，王 偉，徐如冰

（1.河南省生物技術(shù)開發(fā)中心，河南 鄭州 450002；2.河南省植物天然產(chǎn)物開發(fā)工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450002）

伸筋草（Lycopodid Herba）為石松科植物石松（Lycopodium japonicum Thunb.）的干燥全草。《普濟方·諸痹門·風痹》記載，伸筋草辛溫走竄下行之性更善于治療腳膝疼冷[1]。《中華人民共和國藥典》記載，伸筋草微苦、辛，溫，歸肝、脾、腎經(jīng)，可祛風除濕，舒筋活絡，用于關(guān)節(jié)酸痛，屈伸不利[2]。現(xiàn)代藥理研究認為伸筋草具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗血小板凝集等多種功效[3-4]，在臨床應用中，伸筋草多用于膝骨關(guān)節(jié)炎、類風濕關(guān)節(jié)炎、頸肩腰腿痛等疾病的治療[5-6]，是方劑中高頻使用藥物之一。

藥物治療是骨關(guān)節(jié)炎等關(guān)節(jié)疾病的最主要治療方法。但對于高發(fā)病率的老年人群，常見口服藥物如非甾體類抗炎藥具有胃腸出血、損傷腎功能、誘發(fā)和加重心衰等風險[7-8]，開發(fā)透皮吸收外用制劑是骨關(guān)節(jié)炎藥物研發(fā)的重要方向。中華醫(yī)學會骨科學分會發(fā)布的《骨科常見疼痛的處理專家建議》[9]也將外用藥推薦用于治療骨骼肌肉輕、中和重度疼痛。

伸筋草作為骨關(guān)節(jié)炎等關(guān)節(jié)疾病治療常用藥，其外用抗炎鎮(zhèn)痛效果及其作用機制鮮有報道。因此，本研究提取伸筋草并制備凝膠膏，對小鼠經(jīng)皮給藥，采用多種經(jīng)典的炎癥與疼痛模型，如二甲苯致小鼠耳腫脹模型、新鮮蛋清致小鼠足跖腫脹模型、醋酸扭體模型、甲醛致痛模型等，研究伸筋草外用抗炎鎮(zhèn)痛效果，并檢測血漿中TNF-α、IL-1β、IL-6等細胞因子含量，探討伸筋草抗炎鎮(zhèn)痛作用機理，以期為伸筋草相關(guān)藥物深入開發(fā)及臨床應用提供科學基礎。

1 材 料

1.1 實驗動物SPF級雄性昆明種小鼠160只，體質(zhì)量18～22 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK（湘）2016-0002，實驗期間自由飲水和攝食，12 h晝夜節(jié)律變換，濕度50%～70%，溫度（23±1）℃。實驗過程中對動物的處置符合國家科學技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》的要求。

1.2 藥物與試劑 伸筋草藥材購自河南張仲景大藥房股份有限公司，經(jīng)河南省生物技術(shù)開發(fā)中心趙天增研究員鑒定為石松科植物石松Lycopodium japonicum Thunb.的干燥全草，經(jīng)檢測均符合2015年版《中華人民共和國藥典》一部相關(guān)項下要求。青鵬軟膏（西藏奇正藏藥股份有限公司，批號：180306）；蘆丁標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201811）；卡波姆941[科萊恩（廣州）國際貿(mào)易有限公司，批號：20181214]；脫毛膏[利潔時家化（中國）有限公司，批號：20190304]；TNF-ɑ、IL-1β、IL-6 ELISA測定試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號：2146ZP1GHG，QCKNS9ENCE，BLLHR13BUP）；甘油、三乙醇胺、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、甲醛、乙醇（95%）、二甲苯均為分析純，由天津致遠化學試劑有限公司生產(chǎn)。

1.3 主要儀器FW-100高速多功能粉碎機（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；CP224C型電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]；STX2201型便攜式電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]；藥典篩（浙江上虞市金鼎標準篩具廠）；imark酶標儀[伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司]；TU19型紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；SB2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛朗儀器有限公司）。

2 方 法

2.1 伸筋草凝膠膏制備 取伸筋草干燥粉末50 g，置于圓底燒瓶中，加入75%乙醇回流提取2次，料液比分別為1∶10與1∶8，每次40 min。濾過，合并提取液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥，得到伸筋草提取物3.015 g（提取率6.03%），備用。

秤取適量卡波姆941，緩慢加入到適量甘油中，邊加邊攪拌，加入蒸餾水至卡波姆941濃度為1.0%。水凝膠膏溶脹過夜后加入三乙醇胺，調(diào)節(jié)水凝膠pH值范圍為6.5～7.0。秤取適量伸筋草提取物，超聲溶于75%乙醇中，加入水凝膠基質(zhì)中，調(diào)整至生藥濃度為1.0 g/mL和2.0 g/mL。

2.2 伸筋草總黃酮含量測定

2.2.1 標準曲線測定 參考韋松基等[10]的方法稍作修改，以蘆丁為標準品，配制標準溶液濃度為0.300 mg/mL。精密吸取蘆丁標準溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于10 mL容量瓶中，各加75%乙醇至5 mL，再加入5%NaNO2溶液0.5 mL，搖勻，置室溫放置5 min，再加入10%Al（NO3）3溶液0.5 mL，搖勻，置室溫放置5 min，再加入4%NaOH溶液4.0 mL，用75%乙醇定容，搖勻，置室溫放置10 min，以第一份溶液為空白，在紫外分光光度計500 nm處檢測吸收度，以吸收度A為縱坐標，蘆丁溶液濃度C（mg/mL）為橫坐標，繪制濃度-吸光度標準曲線。

2.2.2 伸筋草總黃酮含量測定 取伸筋草提取物0.1 g，加入75%乙醇溶解并置10 mL容量瓶定容得伸筋草溶液。精密吸取伸筋草溶液0.5 mL置于10 mL容量瓶中，按照標準曲線測定項下自“加75%乙醇至5 mL”開始操作，以75%乙醇為空白對照，于500 nm處測定吸光度值，計算伸筋草溶液中總黃酮含量。

2.3 蛋清致小鼠足跖腫脹實驗 隨機取40只小鼠隨機分為模型組、青鵬軟膏組、伸筋草低劑量組、伸筋草高劑量組，每組10只。每只小鼠背部脊柱兩側(cè)脫毛（1 cm×1 cm），脫毛膏涂于小鼠背部脊柱兩側(cè)5 min后，用紗布擦洗凈。模型組小鼠在脫毛區(qū)涂空白凝膠，伸筋草高、低劑量組小鼠涂抹伸筋草凝膠膏，0.15 mL/只，青鵬軟膏組涂抹青鵬軟膏，0.15 mL/只，1次/d，連續(xù)10 d。采用游標卡尺法測定小鼠右后足跖厚度。實驗前測定致炎前足跖厚度。第10天藥物干預30 min后進行致炎造模，對每只小鼠右后足底皮下注射10%蛋清30μL，并于致炎后0.5、1、2、4、6、8 h依次測量各鼠右后足跖厚度，計算足跖腫脹度。每次測定均測量3次，取平均值。

腫脹度=（Ct-C0）/C0，其中，C0表示致炎前足跖厚度，Ct表示致炎后足跖厚度。

2.4 二甲苯致小鼠耳腫脹實驗 小鼠分組與給藥同“2.3”。第10天藥物干預后30 min，小鼠右耳兩面各涂二甲苯36μL，左耳作為對照，30 min后將小鼠頸椎脫臼處死，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑8 mm打孔器分別在同一部位打下圓耳片，用電子天平稱質(zhì)量，計算腫脹度與腫脹抑制率。

腫脹度=右耳片質(zhì)量-左耳片質(zhì)量。腫脹抑制率=（模型組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度）/模型組平均腫脹度×100%。

2.5 甲醛致痛實驗 小鼠分組與給藥同“2.3”。第10天藥物干預后30 min，各小鼠左后足底注射2.5 mL/L甲醛溶液0.04 mL/只，立即計時，分別記錄注射后0～5 min和20～30 min內(nèi)小鼠舔左后足及左后足縮足累積時間，比較各組間的差異。

2.6 醋酸扭體實驗 小鼠分組與給藥同“2.3”。第10天藥物干預后30 min，各小鼠腹腔注射0.6%冰醋酸0.2 mL，觀察記錄注射后20 min內(nèi)各組小鼠的扭體次數(shù)，比較各組間的差異。

2.7 ELISA法測定TNF-ɑ、IL-1β和IL-6含量 醋酸扭體實驗后，各組小鼠摘眼球采血，離心分離制備血漿。分別按照TNF-ɑ、IL-1β和IL-6 ELISA試劑盒說明書操作，根據(jù)標準曲線，計算各組血漿中TNF-ɑ、IL-1β和IL-6含量。

2.8 統(tǒng)計學方法 用SPSS 25.0軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以“均數(shù)±標準差”（±s）表示，經(jīng)正態(tài)分布檢驗后進行比較。各組間兩兩比較采用單因素方差分析（One way ANOVA）LSD檢驗，P〈0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié) 果

3.1 伸筋草提取物中總黃酮含量測定結(jié)果 以吸光度（A）值為縱坐標，以質(zhì)量濃度為橫坐標，進行回歸分析，繪制標準曲線，得到回歸方程為：A=14.282C-0.032 33（R=0.999 9），線性范圍15～75μg/mL。根據(jù)線性方程得出伸筋草提取物中總黃酮含量為4.37 mg/g。由此計算出高、低劑量伸筋草凝膠中總黃酮含量分別為0.52、0.26 mg/mL。

3.2 各組小鼠足跖厚度和足跖腫脹比較 各組小鼠致炎前足跖厚度比較，差異無統(tǒng)計學意義（P〉0.05）。各組小鼠在足跖注射10%新鮮蛋清溶液后均引發(fā)炎癥反應，表現(xiàn)為足跖腫脹，且在致炎后0.5 h達到峰值，之后足跖腫脹度緩慢下降。與模型組比較，青鵬軟膏組和伸筋草高、低劑量組小鼠均表現(xiàn)出一定的抗炎活性。青鵬軟膏組和伸筋草高劑量組小鼠致炎后0.5、1 h足跖厚度明顯下降（P〈0.05或P〈0.01），致炎后1 h小鼠足跖腫脹度明顯下降（P〈0.01）。伸筋草低劑量組小鼠致炎后1、2、8 h足跖厚度均明顯下降（P〈0.05或P〈0.01），致炎后1、2 h足跖腫脹度明顯下降（P〈0.05或P〈0.01）。足跖厚度與腫脹度的時間主效應分析表明致炎后不同時間點小鼠足跖厚度比較，差異有統(tǒng)計學意義（P〈0.01），即存在時間效應，各組均如此。足跖厚度分組主效應分析表明各組小鼠足跖厚度總體比較，差異有統(tǒng)計學意義（P〈0.01），即存在分組效應；各組小鼠跖腫脹度總體比較，差異無統(tǒng)計學意義（P〉0.05），即不存在分組效應。足跖厚度與腫脹度的時間與分組不存在交互效應（P〉0.05）。（見表1～2、圖1）

圖1 交互效應輪廓圖

表1 各組小鼠足跖厚度比較（±s，mm）

表1 各組小鼠足跖厚度比較（±s，mm）

注：F時間主效應=34.603，P時間主效應=0.000；F分組主效應=7.611，P分組主效應=0.001；F交互效應=1.454，P交互效應=0.162；與模型組比較，aP〈0.05，bP〈0.01

組別 動物數(shù)（只）致炎前 0.5 h 1 h 2 h 4 h 6 h 8 h F P模型組 10 2.48±0.04 3.05±0.16 2.99±0.13 2.79±0.10 2.70±0.20 2.75±0.16 2.62±0.14 11.423 0.000伸筋草高劑量組 10 2.46±0.06 2.83±0.15a 2.67±0.13b 2.65±0.18 2.67±0.10 2.61±0.11 2.58±0.12 4.633 0.001伸筋草低劑量組 10 2.43±0.05 2.89±0.09 2.66±0.12b 2.57±0.10b 2.58±0.09 2.62±0.20 2.47±0.10a 9.981 0.000青鵬軟膏組 10 2.45±0.09 2.82±0.14b 2.67±0.12b 2.66±0.09 2.65±0.16 2.66±0.08 2.58±0.04 5.879 0.000 F 0.919 3.515 10.138 3.045 0.734 1.112 2.153 P 0.450 0.034 0.000 0.053 0.544 0.368 0.125

表2 各組小鼠足跖腫脹度比較（±s）

表2 各組小鼠足跖腫脹度比較（±s）

注：F時間主效應=20.765，P時間主效應=0.000；F分組主效應=3.064，P分組主效應=0.052，F(xiàn)交互效應=1.268，P交互效應=0.261；與模型組比較，aP〈0.05，bP〈0.01

組別 動物數(shù)（只） 0.5 h 1 h 2 h 4 h 6 h 8 h F P模型組 10 0.23±0.06 0.20±0.06 0.12±0.06 0.09±0.07 0.11±0.06 0.06±0.06 7.157 0.000伸筋草高劑量組 10 0.15±0.06 0.08±0.05b 0.08±0.06 0.09±0.03 0.06±0.04 0.05±0.03 3.301 0.017伸筋草低劑量組 10 0.19±0.05 0.10±0.07b 0.06±0.05a 0.06±0.04 0.08±0.09 0.02±0.04 5.787 0.001青鵬軟膏組 10 0.15±0.08 0.09±0.05b 0.08±0.03 0.08±0.06 0.08±0.04 0.05±0.04 2.079 0.096 F 1.789 6.050 1.617 0.223 0.493 0.907 P 0.182 0.004 0.217 0.879 0.691 0.455

3.3 對二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 二甲苯涂抹刺激后小鼠耳部明顯充血腫脹（見圖2）。與模型組比較，青鵬軟膏組和伸筋草高、低劑量組小鼠耳腫脹度均明顯下降（P〈0.01），表明伸筋草具有較好的抗炎作用。（見表3）

表3 伸筋草對小鼠耳腫脹的影響

圖2 模型組小鼠二甲苯致耳腫脹情況

3.4 各組小鼠舔左后足時間比較0～5 min時，青鵬軟膏組及伸筋草高、低劑量組小鼠涂藥后舔左后足時間均少于模型組（P〈0.05或P〈0.01）。20～30 min時，青鵬軟膏組及伸筋草高、低劑量組小鼠涂藥后舔左后足時間與模型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P〉0.05）。（見表4）

表4 各組小鼠舔左后足時間比較（±s，s）

表4 各組小鼠舔左后足時間比較（±s，s）

注：與模型組比較，aP〈0.05，bP〈0.01

組別 動物數(shù)（只） 0～5 min 20～30 min模型組 10 41.00±9.13 2.50±3.21伸筋草高劑量組 10 20.05±4.22b 1.67±1.86伸筋草低劑量組 10 28.67±10.50a 4.00±3.27青鵬軟膏組 10 19.17±4.40b 2.17±1.94

3.5 各組小鼠醋酸扭體次數(shù)比較 青鵬軟膏組和伸筋草低劑量組小鼠扭體次數(shù)明顯少于模型組（P〈0.05或P〈0.01）；伸筋草高劑量組醋酸小鼠扭體次數(shù)與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P〉0.05）。（見表5）

表5 各組小鼠醋酸扭體次數(shù)比較（±s）

表5 各組小鼠醋酸扭體次數(shù)比較（±s）

注：與模型組比較，aP〉0.05，bP〈0.01，cP〈0.05

組別 動物數(shù)（只） 扭體次數(shù)（次）模型組 10 49.71±11.63伸筋草高劑量組 10 36.83±13.33a伸筋草低劑量組 10 32.43±12.45b青鵬軟膏組 10 36.71±7.59c

3.6 各組小鼠血漿細胞因子水平比較 青鵬軟膏組和伸筋草高、低劑量組小鼠血漿IL-1β含量均明顯低于模型組（P〈0.05或P〈0.01）；青鵬軟膏組和伸筋草高、低劑量組小鼠TNF-ɑ含量與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P〉0.05）。伸筋草高劑量組小鼠血漿IL-6水平明顯低于模型組（P〈0.05），伸筋草低劑量組和青鵬軟膏組小鼠血漿IL-6水平均低于模型組，但差異無統(tǒng)計學意義（P〉0.05）。（見表6）

表6 各組小鼠血漿TNF-ɑ、IL-1β和IL-6含量比較（±s，pg/mL）

表6 各組小鼠血漿TNF-ɑ、IL-1β和IL-6含量比較（±s，pg/mL）

注：與模型組比較，aP〈0.05，bP〈0.01，cP〉0.05

組別 動物數(shù)（只） TNF-ɑ IL-1β IL-6模型組 10 61.21±8.86 52.86±17.58 105.08±16.36伸筋草高劑量組 10 49.12±7.94c 31.69±6.01a 76.03±6.50a伸筋草低劑量組 10 56.55±3.50c 34.12±11.25a 97.83±15.64c青鵬軟膏組 10 54.68±13.23c 29.42±14.07b 85.99±9.60c

4 討 論

骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機理尚不清楚，臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、晨僵和活動障礙等。骨關(guān)節(jié)炎的治療目標是減輕和消除疼痛，矯正畸形，改善或恢復關(guān)節(jié)功能，提高患者生活質(zhì)量[11]。因此，在關(guān)節(jié)炎治療用藥中，抗炎鎮(zhèn)痛是非常重要的治療手段。非甾體類鎮(zhèn)痛抗炎藥是全世界處方量最大的藥物之一，其不合理使用及不良反應已經(jīng)成為不容忽視的問題。尋找具有抗炎鎮(zhèn)痛作用的中藥及其天然活性成分逐漸受到重視。青鵬軟膏為藏族藥用植物組成的傳統(tǒng)經(jīng)典驗方，具有活血化瘀、消炎止痛的功效，藥效學及臨床研究表明青鵬軟膏對骨關(guān)節(jié)炎類疾病抗炎鎮(zhèn)痛效果明確，且多項臨床研究也均將其作為陽性對照[12-13]，因此本研究選擇青鵬軟膏作為陽性對照藥。

研究認為，伸筋草中的化學成分主要為生物堿類、三萜類及少量的蒽醌類及揮發(fā)油等[14]，化學研究主要集中于提取鑒定伸筋草中新的生物堿類成分，對其他物質(zhì)的研究關(guān)注不多。黃酮類化合物廣泛存在于植物中，通常認為其具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛等多種活性[15]。因此，本研究對伸筋草提取物中黃酮含量進行了測定。抗炎鎮(zhèn)痛活性方面，曾元兒等[16]研究對比了伸筋草不同提取部位的抗炎鎮(zhèn)痛活性；敖鵬等[3]建立了佐劑性關(guān)節(jié)炎模型，研究伸筋草不同提取物對佐劑性關(guān)節(jié)炎的治療作用及其血清細胞因子的作用。以上研究均為經(jīng)口給藥，不能提示伸筋草外用的抗炎鎮(zhèn)痛效果。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，伸筋草外用具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛作用，可開發(fā)成單一外用制劑，用于骨關(guān)節(jié)疾病的治療。

TNF-ɑ、IL-1β、IL-6是參與機體免疫應答、免疫調(diào)節(jié)及炎癥反應的重要細胞因子。TNF-ɑ通過旁分泌和自分泌的形式調(diào)節(jié)細胞和體液免疫，在分子水平上通過結(jié)合受體TNFR1和TNFR2調(diào)控細胞的增殖、分化和凋亡，而過量的TNF-ɑ不僅使其信號通路發(fā)生異常，還可與包括IL-1β、IL-6在內(nèi)的其他促炎性細胞因子參與誘導RANKL依賴的破骨細胞的生成，最終導致關(guān)節(jié)與軟骨的破壞，IL-1β可刺激金屬蛋白酶的產(chǎn)生而加重骨破壞的作用[17]。IL-6被證實在關(guān)節(jié)炎癥中由滑膜成纖維細胞、關(guān)節(jié)軟骨細胞等多種細胞共同分泌，并參與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病和病情進展過程[18]。多項臨床實驗證明，抗TNF-ɑ與抗IL-1β治療，減少TNF-ɑ、IL-1β表達，對治療類風濕性關(guān)節(jié)炎有確切療效[19]。體內(nèi)IL-6水平可早期診斷骨關(guān)節(jié)炎，也可幫助了解患者疾病嚴重程度[20]。本研究對3種炎癥因子的檢測結(jié)果顯示，伸筋草可能是通過抑制IL-1β、IL-6的表達水平達到抗炎鎮(zhèn)痛的作用。伸筋草長期涂抹外用后是否具有緩解疾病進展及關(guān)節(jié)軟骨保護作用等，尚需要采用關(guān)節(jié)炎模型動物進一步研究。