二維液相色譜-串聯質譜法測定嬰幼兒奶粉中的壬基酚

楊晉青，虞成華，翁史昱

（上海市質量監督檢驗技術研究院，上海 200233）

0 引言

壬基酚（nonylphenol，NP）是一種能夠干擾生物和人體激素合成、分泌、傳遞、結合以及消除等環節的環境類激素。相關實驗已經證實NP 的雌激素效應和生物毒性[1-3]。由于壬基酚常作為塑料增塑劑使用，所以塑料食品包裝材料中的壬基酚很容易遷移至食品中，給食品帶來安全風險。壬基酚在剛開始發育的嬰幼兒身上作用將更加明顯，可能對嬰幼兒的內分泌系統造成不可逆轉的影響，使得嬰幼兒性發育速度過快，免疫能力差[4-6]。

目前，檢測壬基酚的方法有酶聯免疫法、液相色譜法、氣相色譜質譜法、液相色譜質譜法等，檢測對象包括包裝材料、水、蛋、牛奶、奶粉、水產品等樣品類型，研究方法也各有不同[7-14]。由于目前缺乏奶粉中壬基酚檢測的國家標準，壬基酚的食品安全風險監測指定檢驗方法為BJS 201913《食品中辛基酚等5 種酚類物質的測定》，該方法前處理過程需要固相萃取柱凈化、氮吹儀濃縮等步驟，容易造成本底值偏高或樣品被污染的相關問題。基于多種分離機理的多維色譜技術由于其操作簡單，前處理時間可大大縮短，已經越來越多的應用到食品分析中[15-16]。本研究將建立一種使用二維液相色譜-串聯質譜法檢測嬰幼兒奶粉中壬基酚的方法，該方法具有操作簡單高效、重復性好、靈敏度高等優點。能夠準確的對奶粉中的壬基酚殘留量進行檢測，為奶粉產品風險監測提供有力技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試劑：甲醇，乙腈，均為色譜純；氨水（分析純），水為符合GB/T 6682 規定的一級水（Milli-Q Synthesis超純水系統制備）。

標準品：壬基酚（CAS號：25154-52-3）純度≥99.0%；壬基酚-13C6（CAS 號：1173020-38-6；100 μg/mL溶于乙腈中），于-20 ℃保存。

1.2 儀器與設備

Thermo U3000 雙三元高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾科技公司；Thermo TSQ QUANTUM UL?TRA 三重四級桿串聯質譜儀，美國賽默飛世爾科技公司；其他設備包括超聲儀，上海鯨德公司；Vortex Ge?nius 3 型漩渦混合器，德國IKA 公司；離心機，德國Ep?pendorf公司。

1.3 標準溶液的配制

1.3.1 標準儲備溶液的配制

準確稱取10.0 mg的壬基酚標準品于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，制備成質量濃度為1 000 mg/L標準儲備液。然后用乙腈稀釋成質量濃度為1 mg/L的標準中間液；壬基酚-13C6則用乙腈稀釋成質量濃度為1 mg/L的內標工作液。

1.3.2 標準工作溶液的配制

分別準確吸取適量標準中間液（1 mg/L），加入同位素內標工作液（1 mg/L），用乙腈稀釋成質量濃度為0.5、1、5、10、20 μg/L和50 μg/L的標準工作溶液。

1.4 儀器條件

1.4.1 液相色譜條件

第一維色譜柱：Waters XBridge C8：2.1 mm× 30 mm，10 μm；第二維色譜柱：Agilent Eclipse plus C18：2.1 mm×100 mm，3.5 μm。A1 和B1 流動相對應泵1，A2 和B2 對應泵2，流動相A1 和A2 為甲醇，流動相B1 和B2 為水。泵1 的流速為2 mL/min，泵2 的流速為0.4 mL/min；柱溫為35 ℃；進樣量100 μL。泵1 和泵2 的梯度如表1 所示。

表1 二維液相梯度洗脫條件

1.4.2 質譜條件

離子源為ESI 源；掃描方式為負離子；鞘氣流量為55 L/min；輔助氣流量為15 L/min；噴霧電壓為-3 500 V；毛細管溫度為350 ℃；碰撞氣為高純氮氣（≥99.999%）；離子傳輸管電壓為73 V，數據采集模式為多反應監測（MRM）。定性定量離子對、碰撞能量等參數如表2 所示，壬基酚的多反應監測（MRM）色譜圖結果如圖1～2所示。

表2 壬基酚的質譜參數

圖1 壬基酚標準品的MRM色譜圖

圖2 樣品中壬基酚的MRM色譜圖

1.4.3 液相色譜-串聯質譜確證

定性測定：被測組分選擇1 個母離子，2 個子離子，在相同實驗條件下，樣品中待測物質的保留時間與標準溶液中對應的保留時間偏差在2.5%之內；且樣品中被測組分定性離子的相對豐度與濃度接近的標準溶液中對應的定性離子的相對豐度進行比較，偏差不超過表3 規定的范圍，則可判定為樣品中存在對應的待測物。

表3 定性確證時相對離子豐度的最大允許偏差

定量測定：將壬基酚標準系列工作液注入液相色譜-串聯質譜儀中，測定相應的峰面積，以標準系列工作溶液中壬基酚與其對應的13C 同位素標記物的濃度比為橫坐標，峰面積比為縱坐標，繪制標準曲線。將試樣溶液注入液相色譜-串聯質譜儀中，得到壬基酚峰面積與對應的同位素內標物峰面積比值，根據標準曲線得到待測液中壬基酚的濃度。

1.5 樣品前處理方法

準確稱取1 g（精確至0.001 g）樣品于15 mL 具塞玻璃試管中，加入0.01 mL同位素內標工作液和10 mL乙腈，渦旋混勻，超聲提取15 min，置冰箱-20 ℃冷凍2 h，取出于8 000 r/min 離心5 min，取上清液過0.22 μm 濾膜后，用液相色譜-串聯質譜儀測定。按上述操作步驟同時進行空白實驗。

2 結果與討論

2.1 流動相的選擇

實驗選用了Agilent Eclipse plus C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）作為實驗用柱，分別比較了水/甲醇，水/乙腈，0.1%氨水溶液/甲醇，0.1%氨水溶液/乙腈，2 mmol/L 乙酸銨/乙腈這幾種流動相對目標化合物離子化程度的影響，研究結果表明，采用水/甲醇作為流動相洗脫，獲得了理想的峰形，質譜信號最強。其他流動相均會使信號降低，這可能是由于使用其他流動相時離子源中濃度過高會抑制壬基酚的電離，從而導致離子化效率下降的緣故。

2.2 二維色譜流路構建與切換時間的確定

二維液相色譜既要考慮2 個維度的體系兼容性，又要考慮這2 個維度存在一定的差異，本研究選用了Waters XBridge C8（2.1 mm× 30 mm，10 μm）作為第一色譜柱，Agilent Eclipse plus C18（2.1 mm×100 mm，3.5 μm）為第二色譜柱。在表1 液相條件下，壬基酚的分離度好，信號響應大，雜質干擾小，如圖1 所示。由圖1 可知壬基酚在第二維色譜柱的保留時間為4.98 min。因此將閥切換時間的設定在3.0 min之后。

二維液相色譜的具體連接方法如圖3 所示。在0～3 min，六通閥處于1 和2 連通狀態，如圖3（a）。樣品經自動進樣器導入第一維色譜柱（在線凈化柱），通過泵1 系統，流動相以一定流速淋洗第一維色譜柱，去除干擾基質，同時將樣品富集在柱頭處。與此同時，第二維色譜柱（分析柱）通過泵2 系統以初始流動相進行平衡；在3～4 min，六通閥處于1 和6 連通狀態，如圖3（b）。此時，第一維色譜柱與第二維色譜柱串聯，通過泵2，流動相將富集在第一維色譜柱上的樣品導入第二維色譜柱中進行分離分析；在4.0～10.0 min，六通閥處于1和2連通狀態，如圖3（a）。此時，第一維色譜柱與第二維色譜柱在各自的流動相條件下沖洗和平衡。

圖3 二維液相色譜系統連接示意圖

2.3 質譜條件的優化

壬基酚具有一定的弱極性或中等極性，選擇電噴霧（ESI）離子源分別在正離子、負離子模式下進行母離子全掃描，對比兩種模式，得出壬基酚負離子模式的離子峰強度比正離子峰強度高很多。而且其分子結構中含有酚羥基，因此選擇負離子模式檢測，首先進行一級母離子全掃描，確定其母離子，再用子離子掃描方式進行二級質譜掃描分析，選擇豐度相對較高、質荷比較大的兩個特征離子碎片分別作為定量離子和輔助定性離子。通過優化離子化電壓、離子源溫度、鞘氣、輔助加熱氣、離子傳輸管電壓、碰撞能量等質譜參數，使壬基酚的母離子與特征碎片子離子的離子對強度達到最大。結果表明：壬基酚在負離子化模式下易形成一級特征離子峰[M-H]-219.3（m/z）和很強的二級特征離子峰為133.1（m/z），具體的二級特征離子峰見圖1。

2.4 樣品前處理方法的確定

本文采用乙腈作為提取溶劑，主要是考慮到乙腈在有效提取目標物的同時具有沉淀蛋白的作用，且帶出的弱極性成分較少。超聲時間是對結果影響較大的因素之一，對5，10，15，20 min 和30 min 不同超聲時間進行了試驗，試驗結果見圖4。結果表明超聲15 min后，樣品的回收率就能達到90%以上。

圖4 不同超聲時間對提取率的影響

2.5 空白試驗的考察

為了盡量降低空白實驗的本底含量，實驗器皿盡量都采用玻璃制品，而且發現濾膜、注射器和進樣小瓶等實驗用品均對空白實驗的本底支有很大影響，如圖5 所示。故建議實驗中使用到的所有有機溶劑和實驗材料，在使用前，必須先考察空白實驗的本底含量。

圖5 空白樣品中壬基酚的MRM色譜圖

2.6 基質效應

質譜的基質效應是指樣品中復雜的干擾物對分析物質譜響應的抑制或增強，可用基質標準曲線與標準曲線斜率的比值進行評估[17]。本工作通過對標準溶液和樣品提取液中的內標的物質的峰面積進行評估，發現壬基酚在奶粉基質中的基質效應比值小于1，存在輕微的基質抑制效應，但可通過內標法對基質效應進行消除。

2.7 線性范圍和檢出限

根據儀器工作條件對標準溶液系列進行測定，以壬基酚的質量濃度為橫坐標，其對應的峰面積與內標物質峰面積的比值為縱坐標繪制標準曲線，壬基酚的質量濃度在0.5～50 μg/L 內與其對應的峰面積與內標物質峰面積的比值呈線性關系，線性回歸方程為y=4.938×10-2x+6.122×10-2，相關系數不小于0.999。以3倍信噪比計算方法的檢出限（3S/N）為0.5 μg/kg，10倍信噪比計算方法的定量限（10S/N）為1.0 μg/kg。BJS 201913 方法的定量限為2.0 μg/kg，該方法可以滿足日常嬰幼兒奶粉中壬基酚的定量需求。

2.8 回收率和精密度試驗

取經檢驗不含壬基酚的嬰幼兒奶粉樣品，分別按樣品中1、2、10 μg/kg 含量水平添加一定量的壬基酚標準溶液，每一添加濃度重復6 份樣品，按上述實驗方法測定，計算其回收率和精密度。得到3 個添加水平下的回收率結果見表5。結果表明：在3 個添加水平下的加標回收率在85.4%～97.3%之間，相對標準偏差為2.08%～5.11%。

表5 壬基酚回收率及精密度（n=6）

2.9 方法比對

按照試驗方法對6 種嬰幼兒奶粉進行測定，同時和BJS 201913《食品中辛基酚等5 種酚類物質的測定》進行比較，比對結果見表6。由表6 可知：本方法和BJS 201913 方法相對偏差小于10%；并經F 檢驗雙樣本方差分析，當a=0.05 時，F=1.01，小于F 臨界值5.05，說明兩組數據無顯著性差異。該方法可用于嬰幼兒奶粉中壬基酚殘留的快速檢測。與BJS 201913 相比，本方法由于省去了前處理過程的固相萃取柱凈化和濃縮步驟，節約了前處理時間，并且降低了本底值偏高或樣品被污染的可能性。

表6 不同測定方法的結果比對

3 結論

本文建立了一種使用二維液相色譜-串聯質譜法檢測嬰幼兒奶粉中壬基酚含量的檢測方法，該方法在0.5～50 μg/L 質量濃度范圍內具有良好的線性，線性相關系數r≥0.999；定量限為1.0 μg/kg；在3 個添加水平下的加標回收率在85.4%～97.3%之間，相對標準偏差為2.08%～5.11%。使用該方法對實際樣品進行檢測，證明該方法具有特異性強、前處理簡單、準確性高、重復性好、靈敏度高等優點，適用于嬰幼兒奶粉中壬基酚的測定。