高等植物陽離子轉運載體OCT 研究進展

張亞楠，歐斯艷，王金祥*

（1.華南農業大學 資源環境學院；2.華南農業大學 根系生物學中心，廣東 廣州 510642）

在植物生長發育過程中，礦質元素、營養物質、信號分子等跨膜轉運和長短距離運輸是必不可少的，而承擔這些任務的主要成員便是轉運子（transporter）（或轉運蛋白）.有趣的是，研究發現植物中有些轉運蛋白既有轉運子的功能，又具有養分受體的功能，如NRT1.1（nitrate transporter 1.1）和IRT1（iron-regulated transporter 1）.這類轉運蛋白被稱為轉運受體蛋白（transceptor）［1-2］.植物有機陽離子包括膽堿、肉堿、多胺，這些有機陽離子在植物生長發育和適應逆境等方面起重要作用，但對有機陽離子如何進出細胞還不清楚.動物四胺有機陽離子主要由SLC22 轉運［3］，SLC22 屬于MFS（major facilitator superfamily）超家族.這些膜蛋白參與動物周圍淋巴器官（peripheral organs）對一些藥物、外來物質、或內源物質的吸收或排泄［4-9］.目前關于植物有機陽離子轉運體（Organic Cation Transporter，OCT）的研究相對較少，主要集中在模式植物擬南芥.本文從植物OCT 蛋白的結構、OCT基因對逆境的響應以及OCT 的功能等進行了綜述.

1 植物OCT 家族

1.1 OCTs 家族蛋白結構的特點

首先在菜豆中鑒定植物OCT基因.Torres 等人在菜豆根中克隆了一個受水分脅迫調控表達的基因，序列分析表明，其全長cDNA 為2 627 bp，含有1 644 個堿基的開放閱讀框，編碼一個長度為547 個氨基酸的蛋白質，與哺乳動物OCT 轉運蛋白家族具有同源性，因此命名為PvOCT1［10］.另外，Lelandais-Briére 等人用PvOCT1 進行的BLASTX 分析，在擬南芥中發現6 個OCT-like 蛋白，分別命名為AtOCT1～6（見表1），其中 AtOCT1 與PvOCT1 有71%的相似性［11］.這些擬南芥OCT 蛋白屬于MFS 轉運蛋白家族的“有機溶質共轉運蛋白”的一個小分支.

TMPred 程序預測結果顯示PvOCT1 蛋白存在12 個跨膜結構域（transmembrane domain，TMD），在TMD1 和TMD2 之間有一個由53 個氨基酸組成的大型胞外結構域，TMD6 和TMD7 之間有一個71 個氨基酸組成的長的中心親水結構域［10］.所有哺乳動物OCT 蛋白都屬于MFS 超家族且都顯示出糖轉運蛋白家族的特征，例如位于TMD6 末端的ESPRXL 基序［12］.植物OCT 蛋白也存在這個基序，如在PvOCT1 蛋白中可以觀察到該基序以及有機離子轉運蛋白的3 個特定結構域［5］.此外，在PvOCT1 中發現了糖轉運蛋白家族和ASF 共有的保守基序，在第151 位發現了1 個cAMP/cGMP 依賴性蛋白激酶的潛在磷酸化位點，在第263、328、389、413、418 和523 位發現了另外6 個蛋白激酶C 位點，在80、81 和295 位發現了3 個可能的N-糖基化位點［10］.

擬南芥基因組共有6 個OCT基因，如表1 所示，其中AtOCT1、AtOCT2、AtOCT3、AtOCT5 和AtOCT6位于1 號染色體，AtOCT4 位于3 號染色體；編碼的蛋白長度介于515～539 個氨基酸.

表1 擬南芥OCT 基因家族基本信息

對擬南芥AtOCT2～6 蛋白質序列進行分析，預測到其具有11～13 個跨膜結構域，且這5 個蛋白的結構非常相似. AtOCT1 結構與其家族的其他成員有所不同［13］. AtOCT1 蛋白有539 個氨基酸，攜帶一些N-糖基化位點和蛋白激酶C 磷酸化位點，且擁有一個非胞質N 端和一個顯著的細胞內中央親水環［11］.AtOCT1蛋白具有SLC22 家族的大多數特征，如TM1 和TM2 之間有一個大環，以及TM2 之前的保守結構域STIVTEWD/NLVC 和TM10 之后的ELYPT；AtOCT1 的TM2 之后的G（X）3G（X）4G（X）3DR/KFGRR/K， TM4 之后的E（X）6R，TM6 之后的PESPRWL，TM8 之后的D/NR/HLGRR，TM10 之后的E（X）6R，以及TM12 之后的PETGK 發揮作用［14-15］.

1.2 OCT 家族的分類

對6 個擬南芥OCTs 和普通菜豆OCT1 氨基酸序列進行進化分析，發現6 個AtOCT 可以分為4 類，并且AtOCT1 和PvOCT1 聚在一起具有很強的同源性［11］. AtOCT2、AtOCT3 和AtOCT5、AtOCT6 分別聚在一起，AtOCT4 獨自成一類.這些結果說明，AtOCT2、AtOCT3、AtOCT5 和AtOCT6 具有相似的功能.

1.3 OCT 亞細胞定位、組織器官的特異性

OCT 蛋白屬于膜蛋白.對AtOCT1 進行原生質體瞬時表達實驗證實了AtOCT1 定位于質膜上；此外，亞細胞定位結果顯示其他5 個成員（AtOCT2～6）都定位于液泡膜［13］.

通過半定量RT-PCR 發現，擬南芥AtOCT1 在所有器官中表達，在生殖器官中含量最高，如花芽、花或未成熟的莢果［11］. PvOCT1 主要在根維管系統表達［10］.有研究發現菜豆PvOCT1 基因在根和莖中表達，在葉柄和莖中也檢測到非常低的轉錄水平［10］.

RNA 印跡分析顯示，擬南芥中5 個液泡OCT基因在不同的器官中有自己獨有的表達方式，AtOCT2一般情況下是弱表達；AtOCT3 的mRNA 僅在長莢果中存在；AtOCT4 的mRNA 在根中表達最強，而在其他器官僅有非常微弱的表達；AtOCT5 在庫葉和源葉表達最強［16］.AtOCT6 和AtOCT4 一樣，主要在根中高表達、莖中表達較弱［13］.

AtOCT1 啟動子在生殖器官中表現出相對較強的活性，尤其是在花藥、萼片、花瓣和花?；钚詮姡辉谟酌珉A段，啟動子僅限于維管系統，在葉和根中活性高，在根的伸長區和根毛區表達活性最高；此外，20%的植物在根冠表現出GUS 活性；發育后期，在葉和莖中的活性下降，但在根中保持較高的活性；根橫切面證實AtOCT1 啟動子活性僅限于維管組織［11］.在菜豆中，通過原位雜交實驗檢測PvOCT1 的組織特異性表達，與莖切片的原位RNA 雜交證實PvOCT1 特異性地定位于韌皮部細胞［10］.AtOCT2 啟動子在花粉粒和柱頭活性高；在成熟莢果的維管組織和幼嫩莢果的種皮中均有表達；對整個擬南芥進行染色，發現AtOCT2 啟動子活性與葉齡相關，AtOCT2 啟動子在除維管系統外的幼葉上表皮、下層細胞、幼葉維管系統的薄壁細胞中，在成熟葉片的韌皮部，在根的維管束、側根的起始點和根尖中均具有活性［5］.和AtOCT2 啟動子不同，AtOCT3 啟動子主要在莢果中表達，特別是發育較早的種子，而不是在莢果皮或較老的種子中；在莖的皮層以下的皮質細胞和實質細胞、在葉的下表皮和上表皮，表皮毛基部、次生花序的基部均有表達.AtOCT4啟動子在幼嫩莢果和莢果的維管組織中都有表達，不同的是，AtOCT4 啟動子在次生花序韌皮部細胞和木質部薄壁組織細胞中也有表達；與AtOCT4 相似的是，AtOCT6 啟動子在次生花序的韌皮部表達，另外AtOCT6 啟動子在花的雄蕊、花絲和藥隔中均有表達；在蓮座葉中，表達僅限于成熟葉的主脈［13］.AtOCT5啟動子活性表達部位還不是很清楚.

2 植物OCT 基因對脅迫的響應

2.1 對水分脅迫的響應

植物OCT1 響應干旱脅迫. Torres 等人的實驗結果表明，脫水1 h 后觀察到的PvOCT1 在根中轉錄水平增加，發生在從頭合成ABA 之前，這說明PvOCT1 對早期干旱的響應不依賴于ABA 信號轉導，而相反，脫水2、5 和8 h 后PvOCT1 的mRNA 豐度減少可能與ABA 合成有關［10］.推測PvOCT1 可能轉運溶質或信號分子參與對缺水的早期反應，它的反應調控機制和脯氨酸轉運蛋白對寒冷或脫水脅迫響應類似［10，17］.AtOCT1 在干旱脅迫下不會被誘導反而會減低積累量，而AtOCT2 和AtOCT3 則完全不響應［13］，AtOCT4～6的轉錄本在干旱處理20 min 后開始積累，持續8 h，在2～4 h 左右累積量最高.

2.2 對冷脅迫響應

植物OCTs響應冷脅迫.植物對低溫信號的響應，目前沒有明確的結論，普遍認為是由于低溫會增加膜的黏性，改變膜的流動性所致.將擬南芥幼苗轉移到4 ℃進行冷處理，RNA 定量分析表明，AtOCT3和AtOCT5 的轉錄水平在誘導后20 min 開始升高，在2 h 以上短暫升高，4 h 后下降.AtOCT1、AtOCT2、AtOCT4 和AtOCT6 對冷脅迫沒有反應［13］.這些結果說明，AtOCT3 和AtOCT5 在轉錄水平響應冷害，但其具體生理功能有待深入研究.

2.3 對鹽脅迫的響應

植物OCTs響應鹽脅迫.AtOCT1 在鹽脅迫下不會被誘導反而會被抑制，AtOCT2 和AtOCT3 對鹽脅迫沒有響應；AtOCT4～6 對鹽脅迫有響應，其中AtOCT4 在鹽脅迫24 h 后達到最高水平，AtOCT5 和AtOCT6的表達量在6 h 后達到最高水平［13］.目前缺乏擬南芥OCT 蛋白水平對鹽脅迫響應的證據，這值得開展研究.鹽脅迫下會引起植物產生滲透脅迫、離子毒害、膜透性改變和生理代謝紊亂等一系列的問題，而植物本身可通過自身的滲透調節進而使自身損害降到最低.AtOCTs是否能通過避鹽機制或耐鹽機制調節植物對鹽害的響應還不清楚.

2.4 對養分脅迫的響應

利用已公開的轉錄組和基因芯片分析數據（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene），對AtOCTs養分脅迫的響應進行了分析，發現AtOCT1 在根和葉均受低磷強烈誘導，分別上調5.95 倍和4.48 倍，而AtOCT5 只在根部受低磷誘導，AtOCT1 受蔗糖下調（表2）.有趣的是，AtOCTs在低氮和低硫脅迫下都無響應.這些結果說明，AtOCT1 和AtOCT5 基因可能在調節植物適應低磷養分脅迫方面發揮作用.磷在植物生長發育中必不可少，廣泛參與植物體內物質合成和能量代謝過程，也是提高作物產量和品質的主要肥料成分之一［18］.植物根系可直接吸收利用土壤中無機態可溶性磷酸鹽，而土壤中大量存在的磷酸酯、磷酸酐等有機磷無法被植物直接吸收.很顯然，多胺如何調節植物響應低磷脅迫，以及AtOCT1 和AtOCT5 在調節根細胞多胺平衡和磷吸收轉運方面所起的作用值得深入研究.

表2 擬南芥OCT 基因家族對非生物逆境的響應

3 植物OCTs 的生理功能

3.1 參與植物體內肉堿和尸胺的轉運

Lelandais-Briére 等人間接證明AtOCT1 介導肉堿的轉運［5，11，16，19］. Strohm 等人發現AtOCT1 的失活可能影響植物細胞中的肉堿循環［20］. T-DNA 插入的AtOCT1 突變體對尸胺（Cad）敏感性增加，而過表達AtOCT1 的擬南芥對Cad 具有抗性，說明AtOCT1 可能是一個Cad 輸出載體［11］. Sagor 等人提出一個模型，在含有較高精胺（Spm）的植物中，Spm 會抑制AtOCT1 肉堿轉運蛋白的活性，從而導致Cad 的積累量更高；若Spm 水平下降，則AtLAT1 和AtOCT1 的肉堿轉運蛋白活性將會發生逆轉，從而導致Cad 進入減少和Cad 外排增加，從而導致Cad 凈積累量降低.

可在根、幼葉和生殖器官的維管組織中檢測到AtOCT1 啟動子的活性，證明了AtOCT1 在長距離運輸中起作用.此外，AtOCT1 在葉脈、花梗、葉頸和側根基部的高水平表達，表明它也可能參與了韌皮部/木質部的物質交換［11］.值得注意的是，氨基酸類化合物的雙向交換已有報道［21-22］.

3.2 OCT 調節植物生長發育

AtOCT1 調節側根的發育.AtOCT1 可能通過直接或間接參與負調控側根發育的化合物的轉運而影響側根的發育.AtOCT1 在側根的維管組織中高表達，并且AtOCT1 功能的喪失導致擬南芥幼苗的側根顯著增加［11］. Strohm 等人對不同品種的擬南芥進行Cad 處理，發現當Cad 濃度增加時抑制主根生長、側根分枝和根部波動的改變［20］.有趣的是，對7 日齡幼苗的半定量RT-PCR 結果顯示，AtOCT3、AtOCT4 和AtOCT6與AtOCT1 存在交叉調控，至少有4 個基因（另外3 個AtOCTs基因和bou）在突變體中的表達受到了 影響［11］.

OCT可能調節花的發育.和其他OCT基因相比，AtOCT2、AtOCT4 基因在花粉優先表達，并且發現AtOCT4 屬于花粉特異性轉運蛋白.在花粉發育過程中，AtOCT2 基因在晚期花粉中表達，只是在三細胞期達到峰值，而在成熟花粉中急劇下降［23］.AtOCT4 基因表達在配子發生過程中首先出現在三細胞或成熟花粉中［24］.這些結果暗示，AtOCT2 和AtOCT4 可能參與調節花的發育.

OCT參與激素互作. AtOCT3 蛋白作為新定位的液泡膜蛋白，其功能尚不清楚，它也可能是葉綠體蛋白，但是需要進一步的實驗來確定其亞細胞定位［24-25］.另外，有研究證實AtOCT3 可能還是二糖轉運蛋白［26］.有趣的是，全基因組關聯分析（genome-wide association studies，GWAS）發現AtOCT3 影響抗性激素ABA 和JA（jasmonic acid，JA）的對話（crosstalk）和對甘藍夜蛾（Mamestra brassicae）的抗性，T-DNA 插入的AtOCT3 突變體對ABA 的敏感性下降，JA 響應基因VSP2 在AtOCT3 突變體的表達水平明顯比野生型Col-8 的低，用AtOCT3 的葉子飼喂的甘藍夜蛾比用Col-8 飼喂的體重大，這些結果說明AtOCT3 通過參與ABA-JA 互作而調節植物的抗蟲性，但具體的生理機制不清楚；和AtOCT3 不同，雖然GWAS 分析揭示AtOCT6 可能是參與ABA-JA 互作的基因，但AtOCT6 的T-DNA 插入突變體和Col-8 的表型沒有區別［27］.

OCT可能參與植物解毒. 2-苯并噁唑酮（Benzoxazolin-2（3H）-one，BOA）是一種有機污染物，BOA可顯著誘導AtOCT5 基因表達［28］.但目前缺乏AtOCT5 突變體和過表達材料對BOA 抗性的實驗結果.擬南芥是否是通過上調AtOCT5 而促進有機陽離子向液泡轉運，進而降低BOA 的毒性還有待深入研究.綜上所述，植物OCT 在生長發育和響應逆境脅迫方面起重要的調控作用.

4 展望

目前來看，對植物OCT基因家族的研究還不夠深入，還有一些科學問題有待回答.AtOCT1～6 在轉錄水平分別由哪些轉錄調控因子進行調控還不清楚.此外，在蛋白水平OCT 是如何進行調控的，是否受磷酸化、泛素化等修飾也需要進行深入研究.在表觀遺傳學的層面，OCT基因是否受DNA 甲基化和組蛋白層面的修飾調控也值得開展研究.特別是基因編輯技術的運用，創造多重OCT突變體，來解析OCT的功能是今后研究的方向.目前對植物OCT基因功能的研究還集中在模式植物擬南芥，而對于有機陽離子轉運體農作物如水稻、玉米、小麥和大豆等作物的OCT基因功能還不清楚.顯然對這些作物OCT基因開展深入研究將有助于全面理解植物OCT基因的功能.

（注：文中OCT 表示蛋白為正體，表示基因為斜體）