蒙藥古日古木對自身免疫性肝炎INF-γ/STAT1通路的作用

李 莎， 楊冬冬， 譚真真， 張子英， 金 蓉， 馬麗杰*

(1.內蒙古醫科大學基礎醫學院藥理學教研室， 呼和浩特 010110； 2.中國醫學科學院藥物研究所， 北京 100050)

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis，AIH)是一種由肝細胞自身免疫介導進行性的肝臟疾病[1]。自1950年6月首次被報道[2]以來，人們對AIH的特征的認識逐漸加深，這類疾病的檢出率逐年升高[3],自身免疫性肝炎以女性為主，發病年齡呈雙峰型，發病高峰是兒童和中年人，尤其是更年期的婦女[4]。

古日古木，即中藥紅花(CarthamustinctoriusL.)為菊科植物。傳統蒙藥成方中，古日古木-13是由紅花、丁香、蓮子、訶子、川楝子、桅子、麥冬、木香、紫檀香、麝香、銀朱、水牛角濃縮粉、牛黃組成的水丸，又稱紅花清肝十三味丸。古日古木-13出自《中華人民共和國衛生部藥品標準》(蒙藥分冊)。臨床實踐中主要應用于肝熱性病中，如脂肪肝、病毒性肝炎、藥物性肝損傷等[5]。研究證明，古日古木通過減少氧自由基生成、抑制一氧化氮(nitric oxide，NO)合成、減少轉化生長因子1(transforming growth factor 1，TGF-1)和基質金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)表達等途徑發揮減輕肝損傷的作用。古日古木中的訶子具有增加白介素2(interleukin-2，IL-2)分泌同時減少白介素8(interleukin-8，IL-8)，進而降低腫瘤壞死因子(tumor necrosis factorα，TNF-α)生成減少炎性反應的作用。而梔子也可以通過清除自由基、調節肝微粒酶作用等途徑有效的保護肝損傷。另外，麥冬、蓮子、麝香、牛黃等也被證明具有保護肝功能的作用[5]。胡建燃等[6]的研究發現紅花作為活血化瘀類中藥可以清除活性氧自由基，具有體外抗氧化和抗補體活性，表明可以在一定程度上應用于自身免疫性疾病的治療。本課題組前期研究證明，古日古木和古日古木-13對CCl4造成的小鼠急性肝損傷具有明顯的保護作用，可能通過提高小鼠肝臟超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，降低丙二醛(malondialdehyde，MDA)及NO含量實現的[7-8]。而在CCl4誘導的小鼠慢性肝損傷模型中，古日古木-13通過降低C-Jun、C-Fos蛋白表達，增加肝再生增強因子ALR表達，并抑制C-Jun氨基末端激酶(C-Jun N-terminal kinase，JNK)信號激活等途徑發揮減輕肝損傷、促進肝修復的作用[9]。本課題組前期研究證明古日古木和古日古木-13也可降低血清堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)等肝臟轉化酶而對刀豆蛋白A(concanavalin A，Con A)誘導的免疫性肝損傷具有保護作用。

在Con A誘導的AIH模型中，IFN-γ/細胞內信號傳導與轉錄激活子1(signal transducer and activator of transcription1，STAT1)/血管細胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)信號通路發揮了重要作用[10]。探討古日古木和古日古木-13對這條通路的影響可能揭示出它們的可能的分子內作用機制之一，為它們在AIH中的應用和進一步研究奠定基礎。

基于此，現應用現代藥理學方法探討蒙藥古日古木單、復方對Con A誘導的小鼠急性自身免疫性肝損傷的保護作用，探索它們對INF-γ/STAT1/VCAM-1信號通路的影響。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

BALB/c小鼠，體重(18±2) g，雌性，8～10周齡，由斯貝福(北京)生物技術有限公司提供，動物許可證號：SCXK(京)2011-0004。小鼠飼養于室溫、濕度55%、12 h晝夜節律的環境中，不限食水，適應性喂養7 d后進行實驗。

1.2 主要藥物與試劑

古日古木，即紅花草藥，購自同仁堂大藥房。古日古木-13(紅花清肝十三味丸)，由內蒙古蒙藥股份有限公司生產，批號：150152。用研缽將古日古木研磨成細粉，過80目篩。加1%吐溫80研磨均勻，分別加蒸餾水溶解并稀配成40、80、160 mg/kg混懸液，用即古日古木低劑量、中劑量、高劑量灌胃液，用前搖勻。古日古木-13灌胃液配制方法同古日古木。

地塞米松磷酸鈉注射液，由鄭州卓峰制藥有限公司生產，批號：150722184，加入生理鹽水配制成0.002 mg/kg的灌胃液。丙氨酸轉移酶(ALT)測定試劑盒(批號：201603)；堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒(批號：201601)；刀豆蛋白A(SLBR620V,Sigma公司)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)測定試劑盒(批號：201601-1)；干擾素-γ(IFN-γ)測定試劑盒(批號：201603-4)(南京博爾迪公司)；細胞凋亡檢測試劑盒(批號：4293719，BD公司)；兔單克隆抗VCAM1抗體(批號：GR257919-27)；羊抗兔抗IgG抗體(批號：GR297013-1)兔多克隆抗STAT1抗體(批號：GR1095-11)；α-Tublin(批號：GR286515-3)(Abcam公司)；兔多克隆p-STAT1抗體(批號：0018，Cell Signaling 公司)NC膜(0.45 μmol/L，批號：MM0006，Pull公司)；ECL Western Blot顯色試劑盒(批號：RE230466)；BCA蛋白定量試劑盒(批號：RL242684，Thermo 公司)。

1.3 主要儀器與設備

酶標儀Multiskan MK3(美國Thermo公司)；電泳儀(美國Bio-Rad公司)；Mastercycler Gradient高速低溫離心機(德國eppendorf公司)；FACS Calibur 流式細胞儀(BD公司)；LeicaCTR6000熒光顯微鏡(Leica 公司)；Tanon-5200化學發光圖像分析儀(北京原平皓生物技術公司)。

2 方法

2.1 動物分組給藥與模型建立

90只雌性BALB/c小鼠隨機分為9組，即空白對照組、模型對照組、陽性對照組、古日古木低、中、高劑量組、古日古木-13低、中、高劑量組。古日古木和古日古木-13低、中、高各劑量組分別給予古日古木和古日古木-13 400、800、1 600 mg/kg進行灌胃；陽性對照組給予0.02 mg/kg地塞米松灌胃；空白組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃。連續灌胃7 d。末次給藥1 h后，尾靜脈注射給予除空白對照組外各組小鼠20 mg/kg的Con A。

2.2 細胞因子檢測

小鼠麻醉下心臟取血，室溫下靜置30 min，1 000 r/min,低溫離心20 min，分離血清。酶聯免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測血清中TNF-α和IFN-γ水平。具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

2.3 TUNEL 法檢測肝細胞凋亡

TdT-mediated dUTP Nick-End labeling(TUNEL)檢測試劑盒實驗說明書說明進行操作。將組織石蠟切片脫蠟至水，蛋白酶K(proteinase K) 37 ℃反應30 min，磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS)洗3遍。用配置好的TUNEL反應液37 ℃避光反應60 min，PBS洗3次。Streptavidin-Fluorescein標記液37 ℃避光反應30 min，PBS洗3次。DAB(diaminobenzidine)顯色，蘇木素復染3 s后沖洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。光學顯微鏡下觀察。

2.4 流式細胞術檢測肝細胞凋亡

取新鮮的肝組織剪碎制成細胞懸液，加入結合緩沖液(1×binding Buffer)重懸細胞，調整濃度為106cells/mL，每管加5 μL 膜聯蛋白V(annexin V)和2.5 μL碘化丙啶(propidine iodide, PI)于重懸細胞液中，避光孵育15 min，最后加400 μL 1×binding Buffer后使用流式細胞儀進行檢測，Annexin V為綠色熒光代表早期凋亡細胞，PI將核染為紅色，標記中晚期凋亡細胞。

2.5 蛋白質免疫印跡法(WB)檢測各組小鼠肝組織STAT1、p-STAT1、VCAM-1表達

提取小鼠肝細胞總蛋白，BCA法測定蛋白含量，聚丙烯酰胺凝膠電泳1.5 h，電轉2 h，脫脂奶粉封閉，加入一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，加入二抗稀釋液室溫孵育1 h，洗膜緩沖液(tris buffered saline tween，TBST)洗3次，每次10 min；超敏化學發光顯影液發光，儀器攝影。

2.6 統計學處理

3 結果分析

3.1 對小鼠血清中炎性細胞因子水平的影響

與空白對照組相比，模型對照組TNF-α和IFN-γ水平顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，與模型對照組相比，古日古木-13中、高劑量TNF-α水平顯著降低(P<0.05)。古日古木高劑量組、古日古木-13對自身免疫性肝損傷有保護作用且作用強度呈劑量依賴性，保護作用可能是通過降低炎性細胞因子IFN-γ實現的，如表1所示。

表1 對ConA所致小鼠肝損傷TNF-α、IFN-γ活力的影響Table 1 Effect of TNF-α and IFN-γ activity in liver injury induced by Con A in mice

3.2 古日古木、古日古木-13對肝細胞凋亡的影響

TUNEL標記定位于肝細胞核，正常肝細胞核藍染，凋亡肝細胞核呈棕黃色。空白對照組肝細胞排列整齊，結構清晰，胞質淡染，細胞核呈藍色且體積較大。模型對照組細胞結構破壞，界限不清，絕大部分細胞核皺縮并出現棕黃色著染，提示這些這些細胞已經發生凋亡，其余未染色細胞變小，胞膜完整但出現發泡現象。各給藥組的肝細胞均出現不同程度的細胞核皺縮、著染。其中古日古木各劑量組著染程度較重，古日古木-13各劑量組著染程度較輕，提示復方各劑量組對干細胞凋亡的保護作用較顯著，尤其是復方中劑量組和高劑量組，如圖1所示。

圖1 TUNEL法檢測肝細胞凋亡(10×40)Fig.1 Apoptosis was measured by TUNEL staining(10×40)

由圖2和表2可知，流式細胞儀 (flow cytometry，FCM)測凋亡能力結果顯示：與空白對照組相比，模型對照組的細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與模型對照組相比，古日古木和古日古木-13各劑量組均能明顯降低肝細胞的凋亡率(P<0.05)，說明經過古日古木和古日古木-13處理后，大鼠肝細胞凋亡能力降低。其中古日古木低劑量組、中劑量組降低幅度較小，其余4組降低幅度較大，但4組間沒有顯著差異。另外，古日古木、古日古木-13各劑量組的細胞凋亡率均明顯高于陽性對照組。

圖2 各組小鼠肝細胞凋亡情況Fig.2 Hepatocytes apoptosis in each group

表2 各組小鼠肝細胞凋亡率比較Table 2 The apoptosis rate of hepatocytes in each group was compared

3.3 Western Blot檢測肝組織內STAT1、p-STAT1和VCAM-1蛋白表達情況

Western Blot結果表明，與空白對照組相比，模型組小鼠肝組織內STAT1蛋白、p-STAT1蛋白和VCAM-1蛋白表達量明顯升高。與模型組相比，除古日古木-13中劑量組外，其他給藥組STAT1蛋白表達均顯著降低(P<0.05)；除古日古木低劑量組外，其余給藥組p-STAT1蛋白均顯著降低(P<0.05)，尤其是古日古木-13高劑量組。所有給藥組的VCAM-1蛋白表達量均顯著降低(P<0.05)，尤其是古日古木-13高劑量組和古日古木-13低劑量組。提示藥物影響上述蛋白分子的表達方面劑量依賴性不明顯。如圖3和圖4所示。

圖3 蛋白印跡檢測細胞凋亡相關蛋白表達Fig.3 Expression of apoptosis related proteins was tested by western blot

*為與空白對照組比較， P<0.05；#為與模型組比較， P<0.05圖4 蛋白印跡檢測細胞凋亡相關蛋白表達Fig.4 Expression of apoptosis related proteins was tested by western blot

4 討論

目前鮮有針對AIH病因的治療，主要采用非特異性免疫抑制：潑尼松龍或者與免疫抑制劑聯合應用。但約有70%應用免疫抑制劑停藥后會再次復發[11]。基于蒙藥古日古木和古日古木-13在肝病治療中已經具備大量臨床成功經驗，探索它們在自身免疫性肝炎中的治療作用和作用機制，可能提供新的更為安全的治療手段。刀豆蛋白A(concanavalin A,Con A)廣泛應用于誘導的免疫性肝損傷動物模型[12]。Con A是一種提取自刀豆的可以促進T細胞有絲分裂的植物凝集素,它可以刺激T細胞，快速誘導產生肝臟轉氨酶升高和大量T細胞浸潤，繼而引發肝臟組織壞死，導致AIH[13]。常見的給藥劑量為10～30 mg/kg，常見取樣時間則以給藥后4～24 h[14]，由前期實驗的血清生化檢測結果可知，給予小鼠20 mg/kg Con A刺激16 h后進行取樣可以得到理想的急性免疫性肝損傷模型。

AIH的發病機制，較為公認的觀點是腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和干擾素-γ(IFN-γ)是誘導炎癥反應的主要介質[13]。文獻[15-17]發現TNF-α和INF-γ是自身免疫性肝細胞損傷的病原學原因，Mizuhara等[18]、Gantner等[19]發現Con A誘導的小鼠肝損傷與TNF-α有關。Wang等[20]進一步發現TNF-α和IFN-γ都是ConA誘導肝炎的主要介質。TNF-α以其可溶性形式和膜結合前體形式參與介導Con A肝炎，抑制細胞分裂并促進凋亡。而IFN-γ可以促進巨噬細胞和自然殺傷細胞的活化與增殖，促進主要組織相容性復合物Ⅱ的表達，因此參與肝損傷的形成[12-13,21]。已經上市的已經上市的TNF-α中和抗體英夫利昔單抗對AIH具有臨床療效，但僅僅體現在個別病例上，尚無大規模的研究證明[22-24]。而目前已經在使用的干擾素中和性抗體類藥物主要是IFN-α類，用于治療病毒性肝炎，在治療AIH方面鮮有報道[25]。本文研究中發現古日古木-13中、高劑量給藥組對TNF-α有明顯的降低作用，古日古木中、高劑量組、古日古木-13所有劑量對IFN-γ有明顯的降低作用。說明藥物對IFN-γ的影響更為顯著。提示藥物對AIH的保護作用主要是通過降低炎性細胞因子IFN-γ來實現的。

肝損傷發生時，細胞內多種機制都可以參與誘導受損的肝細胞發生凋亡，如Fas介導、肝內浸潤淋巴細胞凋亡減少導致的的肝細胞凋亡等[26]。原位末端標記(TdT-mediated dUTP nick end labeling,TUNEL)法和流式細胞術是兩種檢測細胞凋亡常用的方法。TUNEL法能夠精確定位組織切片上的凋亡細胞，敏感性極高，但它只能標記中、晚期凋亡細胞，且凋亡細胞計數時易受主觀因素的影響；而流式細胞術具有簡單、快速、準確的有點，但它不能區分晚期凋亡與壞死細胞[27]。本文研究中利用兩種方法檢測給與Con A后小鼠肝細胞的凋亡情況，互相印證、補充。結果表明古日古木、古日古木-13各個劑量組均能夠明顯抑制Con A引起的肝細胞的凋亡，尤其是古日古木高劑量組和古日古木-13的三個劑量組。但這4組間的細胞凋亡率并不存在顯著差異，與預想的劑量依賴趨勢并不符合。這說明，提高濃度也許并不能增加古日古木-13的抗凋亡效果。

IFN-γ受體由IFNGR1和IFNGR2兩個亞單位組成，與IFN-γ結合后，它們分別引起JAK1和AK2活化。活化的JAKs磷酸化IFN-γ受體的胞內部分，進而引起STAT1的Tyr-701殘基磷酸化。磷酸化的STAT1自受體結合部位釋放入細胞形成二聚體之后進入細胞核調控目標基因的轉錄，包括一氧化氮合酶(iNOS)、干擾素誘導蛋白-10(IP-10)和IFN-γ誘生的單核因子(Mig)，以及干擾素調節因子(IRF-1)[28-29]。IRF-1是一種可以調控若干抗病毒和抗凋亡基因、調節機體對病原體的固有免疫及適應性免疫的轉錄因子。研究發現，Con A肝炎發生時，小鼠體內的IRF-1表達明顯增加[30]，且IRF-1-/-小鼠對Con A敏感度降低[31]。INF-γ/STAT1/IRF-1信號通路可以誘導產生細胞間黏附分子-1(ICM-1)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)、CC類趨化因子配體-20(CCL-20),上皮來源的中性粒細胞活化肽-78 (ENA-78)，干擾素誘導T細胞α趨化因子(I-TAC)、Mig以及IP-10等多種趨化因子和黏附分子，它們促進白細胞的浸潤，發揮促炎作用參與AIH的形成[32]。結果表明，古日古木和古日古木-13對INF-γ/STAT1信號通路有影響，尤其是古日古木-13高劑量組最為明顯，抑制INF-γ/STAT1信號通路并減少其下游分子VCAM-1的表達很有可能是藥物抑制AIH的作用機制之一。

5 結論

綜上所述，古日古木和古日古木-13均能不同程度的保護Con A導致的小鼠急性自身免疫性肝損傷，其機制可能是通過降低炎癥因子的釋放、減輕肝臟組織學改變、抑制INF-γ/STAT1信號通路及其下游效應分子VCAM-1，進而減輕炎癥反應，同時減輕肝細胞凋亡來發揮保護肝臟作用的。