羥基磷灰石在脂肪干細胞相關骨組織工程中的應用熱點研究*

申 杰，張司璽，曹志威，張春陽，趙志軍

(1.內蒙古科技大學包頭醫學院,內蒙古 包頭 014010;2.內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院神經外科;3.內蒙古自治區骨組織再生與損傷修復工程技術中心)

脂肪干細胞(Adipose Derived Stem Cells,ADSCs)是近年來被廣泛研究具有自我復制和多向分化潛能的間充質干細胞。具有明確的定向成骨分化能力、自身儲存量巨大且易于提取與分離、體外培養能夠穩定增殖傳代，且較低的免疫原性可用于自體移植等優點，廣泛應用于各類與骨組織相關的科學研究領域中[1-2]。隨著材料制造技術的進步，重建天然細胞外基質(ECM)結構、誘導細胞成骨礦化、更好的骨力學性能成為羥基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)及其相關材料新的發展方向。本文從HA及其多種新型材料的成分組成及結構特性以及對ADSCs增殖活性及成骨分化的不同影響入手，通過對近年來出現的多種新型HA支架材料進行總結，旨在為HA及ADSCs所構成的生物組織工程骨的基礎研究與應用發展提供更多的借鑒和指導。

1 單純HA及其納米材料

ADSCs成骨特性主要受誘導環境及成骨誘導因子影響，HA具有良好的骨傳導性及化學穩定性，且人工合成的HA與正常人體骨組織中無機成分高度相似，可塑的孔隙結構能夠促進ADSCs成骨分化的特點使HA成為ADSCs在骨組織工程中最常應用的支架材料之一。程勝承等[3]將ADSCs與HA共培養時發現，HA的存在可以提升ADSCs成骨標志物—堿性磷酸酶(ALP)活性及相關成骨基因COL1A1、OPN、Runx2的表達水平，且梯度培養證明，濃度為20 mg/L的HA成骨誘導能力最佳，但隨著HA濃度提升，反而會抑制ADSCs增殖。

隨著納米科技的發展，納米羥基磷灰石(Nano-Hydroxyapatite，nHA)以其較小粒徑，能夠釋放Ca2+和PO43-促進ADSCs成骨分化[4]。與ADSCs混合制成基質膠注射入骨髓腔中，治療I型成骨不全[5]。通過電子顯微鏡觀察發現，nHA納米微環境擁有相互連通的孔隙類似于天然細胞外基質(ECM)結構，可提高相關分子的傳輸效率，并為ADSCs的附著提供充足接觸面積，而這種特殊的納米結構很可能與細胞黏著斑(Focaladhesion)之間存在一定的相互作用[6]。因此nHA可在缺乏成骨誘導環境的情況下促進ADSCs定向分化為成熟骨細胞。

2 共聚復合材料

盡管單純HA具有良好的可塑性，但其如陶瓷般的脆性及較差的延展性等缺點，很大程度上限制其在骨組織工程中的應用前景。增加適度的柔韌性，提升其斷裂伸長率并改善HA的力學性能,甚至通過重塑微環境結構使其更有利于ADSCs的貼附生長及成骨礦化，與其他生物材料進行共聚復合成為HA改性的重要方法。Wang等[7]將聚癸二酸甘油酯(PGS)中的氫氧根替換馬來酸酐(gM)并與HA復合制成新型nHA/PGS-M復合支架，擁有良好回彈力的同時，150～300 μm大小的孔隙結構在接種ADSCs之后可以促進其成骨分化，Runx2、骨鈣素、Col1A1等成骨相關因子表達也增高。

膠原蛋白(Collagen)及其水解產物明膠(Gelatin)均具有良好的生物活性及結構彈性，成為改善HA固有脆性的復合選擇。Weiss-Bilka等[8]將HA與膠原蛋白復合，制成擁有較高孔隙率、適宜手術固定的圓孔結構、良好彈性及延展性的支架材料，這種新型的膠原蛋白/HA復合支架不僅能夠促進ADSCs向成骨細胞分化，還能促進血管生成以及鈣質沉積。Mazzoni等[9]也研發制備名為Coll/Pro Osteon 200的新型HA/膠原蛋白共聚支架，復合ADSCs用于治療頜面部骨缺損病人并取得良好療效，ALP、OGN和CLEC3B等基因的表達增高，臨床評估顯示該新型支架材料有促進ADSCs成骨分化及骨骼再生的作用。而在明膠與HA共聚應用方面，Sattary等[10]使用電紡絲技術成功制備聚己內酯/明膠/nHA/Vit D3新型復合支架，兼具柔韌性的同時nHA與Vit D3協同作用使ADSCs的成骨分化能力大大提升，ALP和Runx2的成骨表達期提前21 d。Wenz等[11]將甲基丙烯酰基修飾后的明膠與nHA復合而成三維支架，將ADSCs與人真皮微血管內皮細胞(HDMEC)共同封裝進行培養14 d后，ADSCs成骨分化能力增強，同時微血管的穩定增殖也有利于ADSCs分化和增殖。Amjadian等[12]將左旋聚乳酸(PLLA)與明膠采用靜電紡絲技術合成納米纖維，再將nHA嵌入其中制成新型支架材料，將常用的成骨誘導成分—地塞米松滲入支架孔隙之中，用以誘導ADSCs的成骨分化并取得明確效果。ALP活性、鈣鹽沉積和相關成骨基因表達均增加，而這種新型支架優異的機械強度和拉伸性使其成為骨組織工程中支架材料的優秀選擇。Lee等[13]也做過類似研究，其在PLLA/明膠/HA支架材料中，利用PLLA的藥物控釋特性將辛伐他丁(Simvastatin，SIM)包封其中，同時用β-環糊精(β-CD)作為連接劑穩定支架的力學性能(如圖1)，ALP及茜素紅染色顯示這種支架材料不僅能夠促進ADSCs礦化，同時相較于無SIM的對照組，Runx2等成骨基因表達上調,說明SIM修飾的新型支架對ADSCs的成骨分化能力也具有促進作用。

圖1 β-環糊精修飾并控釋辛伐他丁的PLLA/明膠/HA支架

絲素蛋白(Silk Fibroin，SF)是通過去除蠶絲中的絲膠，避免免疫排斥反應而獲得的一種天然可降解的高分子纖維蛋白，具有良好的降解性、可塑性、生物相容性和力學性能等，優點使其在外科領域中有著廣泛的應用歷史。利用SF的優良韌性和可降解性，改變HA降解緩慢且脆性較高的缺點。施詠毅[14]將復合ADSCs的SF/HA支架植入兔股骨遠端骨缺損取得了較好的修復效果。劉浩等[15]利用3 mL濃度為1 %的絲素蛋白與480 mg的nHA干粉混合干燥后，制備SF/HA支架，在接種ADSCs后通過MTT法和堿性磷酸酶分別檢測其細胞活性和成骨能力后發現，相較于兩種單純材料，復合后的新型材料不僅在力學性能和結構強度上有更好的表現，其促成骨能力也更強。丁曉明等[16]采用相分離/瀝濾技術制備的SF/HA多孔性支架擁有更好的結構性能，其均勻且相互連通的多孔結構更適宜ADSCs的貼附和生長，隨著誘導時間的延長，相關成骨基因OPN及Osteonectin的表達量也隨之增加。Eunkyung等[17]也利用靜電紡絲技術,將HA顆粒混合于絲素蛋白納米材料中,通過粘附性聚多巴胺(PDA)將另一部分HA顆粒固定于材料表面形成層功能化HA/SF納米支架材料(如圖2)，不僅其力學性能得到改善，且能夠為ADSCs提供更為優異的成骨礦化環境。通過質粒轉染轉錄共激活因子(TAZ)對ADSCs進行基因修飾進一步增強其成骨能力，并在動物模型中實現較好的臨界大、小顱骨缺損修復效果[17]。丁濤等[18]更是在SF/HA支架的基礎上，復合經骨形態發生蛋白-14(BMP-14)轉染的ADSCs修復大鼠尾椎缺損，這種支架材料不僅能夠促進ADSCs的黏附和增殖，同時BMP-14促進ADSCs成骨分化并與SF/HA融合形成新骨，術后8周可見修復部位骨密度增高，并有大量骨痂形成。

圖2 雙層功能化HA/SF納米支架結構示意圖

β-磷酸三鈣(β-Calcium Phosphate Tribasic，β-TCP)由鈣和磷構成，是磷酸三鈣的高溫相，具有良好的生物相容性、能與骨組織直接融合、無炎癥等不良反應的優點，使其成為骨組織工程領域的常用材料。其鈣磷原子比為1.5，相比HA更易在體內降解吸收，同時與HA復合而成的HA/β-TCP支架，可根據其不同的表面構造、結晶構型決定其支架材料的強度和體內降解速率，適宜的孔隙大小能夠更好的引導ADSCs遷移和增殖，促進ADSCs向成骨細胞分化。王騰飛等[19]利用成分比為6∶4的HA/β-TCP支架材料搭載ADSCs后修復兔腰椎缺損，修補區的新型材料基本降解吸收，實現材料與正常骨組織的骨性結合。Hashemibeni等[20]將ADSCs復合于HA/β-TCP后，用以修補犬脛骨圓柱形骨缺損后發現，相較于單純使用HA/β-TCP在修補部位形成更加厚實的骨小梁和礦化基質，修復后的骨質硬度較好。吳洪亮[21]也利用HA/β-TCP作為人工骨支架載體，復合經低氧誘導因子-1α(Hypoxia Inducible Factor-1α,HIF-1α)轉染的ADSCs后對兔股骨頭壞死進行移植修復，利用HIF-1α的高表達促進血管生成以改善缺血現象，同時礦化的ADSCs復合HA/β-TCP實現較好的股骨頭再生，這不僅為骨組織工程學應用于臨床復雜結構的骨修復建立了實驗基礎，同時也為骨替代治療中血管生成這一難題提供了新的思路和方向。

聚乳酸(Polylactic Acid，PLA)是一種可由淀粉原料提煉制成的新型生物可降解材料，其良好的可塑性，降解無毒及藥物控釋等特性在材料及藥物領域被廣泛研究。在上述HA與明膠共聚物的骨修復研究中，聚乳酸多次出現。Smieszek等[22]更是發現左旋聚乳酸(PLLA)與nHA最適配比，當nHA在聚合材料中占比10 %時ADSCs的黏附力及其增殖活性最好。與此同時，聚乳酸還有另外一種與HA合作的特別方式，Ma等[23]采用流動蒸發法在nHA的表面形成一層PLA納米膜，其nHA側可以有效促進ADSCs成骨分化，PLA膜的隔絕效果可以有效防止ADSCs與其他組織細胞共同黏附于HA材料表面造成的組織粘連，達到更好的骨缺損修復效果。

3 元素修飾材料

通過復合其他生物材料達到HA改性之外，一些元素的修飾和摻雜也可以發揮類似作用。鍶元素(Sr)是一種類似鈣生物學功能的人體所需微量元素之一，可以取代骨基質中HA的鈣而提升骨質強度，因此臨床中常用雷奈酸鍶治療骨質疏松。鍶對ADSCs的成骨分化具有明確作用，因此陳龍[24]將鍶修飾于HA支架，不僅能提升HA支架的力學性能和結構強度，還能有效提高ALP活性，加速ADSCs的礦化成骨。硼元素(P)也是人體所需微量元素之一，雖然還未闡明其在胚胎或人體發育中的具體機制，但硼對人體骨骼再生作用已經充分得到證實[25]。Akdere等[26]將硼元素添加至HA相關支架材料中，在不同的2D和3D培養環境中均較無硼材料更能促進ADSCs的黏附、增殖及成骨分化，骨傳導性也更好。硅(Si)是自然界極為常見的一種元素，在骨組織工程中也得到廣泛應用。Eatemad等[27]為改善HA降解速率慢的缺點，將硅元素加入到HA的支架材料中，復合ADSCs后發現硅元素的存在不會對ADSCs產生毒性作用，HA經硅修飾后形成的Si-HA微粒有較高的降解速率，能夠釋放出更多的離子并促進ADSCs成骨及基質礦化，這些元素的摻雜和修飾不僅能夠在HA基礎上對ADSCs的生物活性和成骨礦化起到一定的促進作用，同時也為相關特殊骨組織疾病的修復治療提供更多的生物支架和涂層材料的個性化選擇與應用。

4 結語與展望

HA作為最常用的骨替代材料被廣泛應用，但隨著骨組織工程學的不斷發展，與其他學科諸如材料化學、臨床醫學的不斷交融，單一材料的使用缺陷被逐漸放大，因此擁有更優性能的多種復合材料為HA相關材料在骨組織工程中的應用開辟了新道路。與此同時，HA對ADSCs成骨特性的改變也在HA相關材料的不斷發展中得到更好表現，但制約其真正應用于臨床還有許多問題有待解決。如調配HA相關骨組織工程材料內部各成分的比例，以適應修補缺損部位所需的結構強度和ADSCs生長﹑吸附的孔徑大小；其降解控釋速率如何匹配新骨生成而不至于過快導致支架塌陷或過慢限制骨細胞增殖；血管生成這一關鍵問題在HA相關材料臨床應用中如何有效解決等。HA相關支架材料的不斷研究與發展，提升ADSCs成骨和礦化能力，優化其結構與力學特性，實現更好的骨缺損修復效果，對骨組織工程的應用和前景有著十分重要的意義。