基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討平消片治療胃癌的作用機(jī)制*

郭雪梅，馬詩瑜，邱文超，陳柯村，汪 猛，秦凱健

（1.同濟(jì)大學(xué)附屬上海市第四人民醫(yī)院，上海 200434；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院，上海 200023；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200437）

胃癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一，近年盡管在診斷和治療方面取得了進(jìn)展，但胃癌患者的預(yù)后仍不理想[1]。中醫(yī)藥防治惡性腫瘤有其獨(dú)特的思路與方法，多項(xiàng)研究表明，中西醫(yī)結(jié)合治療對于延長胃癌患者生存時間、減輕放化療不良反應(yīng)、改善生活質(zhì)量均有一定貢獻(xiàn)[2]。

平消片由郁金、馬錢子粉、仙鶴草、五靈脂、白礬、硝石、干漆（制）、枳殼組成，是我國自主研發(fā)的抗腫瘤中成藥，臨床應(yīng)用廣泛。我國中醫(yī)腫瘤專家賈堃創(chuàng)制了該組方，并將其用于治療胃癌初起及病情進(jìn)展患者[3]。中醫(yī)腫瘤學(xué)者劉嘉湘[4]、孫桂芝[5]等也指出平消片可作為治療胃癌的中成藥之一。臨床研究表明，該中藥復(fù)方可有效增強(qiáng)放化療療效，降低放化療毒副反應(yīng)，提高腫瘤患者生存質(zhì)量[6]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在數(shù)據(jù)庫檢索、高通量組學(xué)數(shù)據(jù)分析和計算機(jī)模擬等手段基礎(chǔ)上，通過多層次網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析，實(shí)現(xiàn)藥物作用機(jī)制預(yù)測等研究目的，其研究策略的整體性、系統(tǒng)性特點(diǎn)與中醫(yī)學(xué)基于整體觀去診治疾病的理論不謀而合[7]。本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討平消片在胃癌治療中的作用機(jī)制，為實(shí)驗(yàn)和臨床研究提供參考。

1 方 法

1.1 收集平消片治療胃癌的靶點(diǎn) 使用ETCM數(shù)據(jù)庫（參數(shù)：Tanimoto Scores＞0.8）[8]收集平消片的作用靶點(diǎn)。ETCM由中國中醫(yī)科學(xué)院開發(fā)，數(shù)據(jù)庫提供了方劑、中藥及其成分的預(yù)測靶基因，可用于挖掘中藥、方劑、成分、基因靶標(biāo)、通路和疾病之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系。采用Uniport數(shù)據(jù)庫[9]對預(yù)測靶點(diǎn)名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。利用Metascape數(shù)據(jù)庫[10]分析平消片靶點(diǎn)可作用的疾病類型。

使用DisGeNET數(shù)據(jù)庫（參數(shù)：Score_gda≥0.3）[11]和Comparative Toxicogenomics Database數(shù)據(jù)庫（參數(shù)：Inference Score≥40）[12]收集胃癌疾病的靶點(diǎn)。匯總、整理上述疾病靶點(diǎn)，并使用Uniprot數(shù)據(jù)庫[9]對靶點(diǎn)名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

基于Venny2.1在線工具（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）和Metascape數(shù)據(jù)庫[10]對平消片作用靶點(diǎn)和胃癌疾病靶點(diǎn)取交集，獲得平消片治療胃癌的潛在作用靶點(diǎn)。

1.2 作用靶點(diǎn)富集分析 基于潛在作用靶點(diǎn)，使用Metascape[10]進(jìn)行GO和KEGG富集分析（參數(shù)：min overlap：3，P value cutoff：0.01，min enrichment：1.5）挖掘平消片治療胃癌的作用機(jī)制。其中GO富集分析根據(jù)生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）類別對靶點(diǎn)進(jìn)行注釋和分類。MCODE（molecular complex detection）算法[13]也被用于識別密切關(guān)聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)并對結(jié)果進(jìn)行富集分析。

1.3 構(gòu)建靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 基于STRING數(shù)據(jù)庫對平消片抗胃癌靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建（參數(shù)：interaction score≥0.40）[14]。利用Cytoscape 3.7.2軟件（Cytohubba-MCC模塊）獲得核心靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)[15]。采用Metascape數(shù)據(jù)庫（TRRUST模塊）[10,16]挖掘平消片抗胃癌靶點(diǎn)的潛在轉(zhuǎn)錄因子。

1.4 腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞浸潤分析 使用TIMER數(shù)據(jù)庫（Gene module模塊）[17]，分析核心靶點(diǎn)基因表達(dá)情況和不同免疫細(xì)胞豐度的關(guān)系，評估免疫細(xì)胞的浸潤情況。

1.5 作用靶點(diǎn)臨床意義及預(yù)后分析 使用GEPIA2數(shù)據(jù)庫[18]，基于胃癌患者臨床樣本獲取腫瘤和正常組織的基因表達(dá)情況，對平消片抗胃癌靶點(diǎn)進(jìn)行主成分分析。同時，挖掘核心靶點(diǎn)在胃癌不同病理階段的基因表達(dá)情況，及其對胃癌患者總生存期和無病生存期的影響，評估其預(yù)后價值。

2 結(jié) 果

2.1 平消片作用的疾病類型及其抗胃癌靶點(diǎn) 經(jīng)篩選整理，共獲取平消片作用靶點(diǎn)167個、胃癌疾病靶點(diǎn)1 063個。平消片作用的疾病類型依據(jù)P值排序，包括多種腫瘤及心理或情緒障礙等。（見圖1）平消片作用靶點(diǎn)與胃癌疾病靶點(diǎn)的交集圖顯示有38個共同靶點(diǎn)，即平消片抗胃癌作用的潛在靶點(diǎn)。（見圖2A）基于Metascape數(shù)據(jù)庫將平消片作用靶點(diǎn)映射于胃癌疾病靶點(diǎn)，其中外圈紅色代表胃癌靶點(diǎn)，藍(lán)色代表平消片靶點(diǎn)；內(nèi)圈深橙色弧及紫色連線，提示平消片與胃癌靶點(diǎn)重合情況；藍(lán)色連線提示兩者靶點(diǎn)的功能重合情況。（見圖2B）

圖1 平消片作用的疾病類型

圖2 平消片與胃癌靶點(diǎn)的交集

2.2平消片抗胃癌作用靶點(diǎn)富集分析 富集分析表明，平消片的抗胃癌靶點(diǎn)涉及多種作用途徑，分析結(jié)果依據(jù)P值排序。GO富集分析，經(jīng)過篩選后發(fā)現(xiàn)包括調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝過程（regulation of lipid metabolic process）、調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)（regulation of inflammatory response）、細(xì)胞對外界刺激的反應(yīng)（cellular response to external stimulus）、氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）等。（見圖3）KEGG富集分析，經(jīng)過篩選后發(fā)現(xiàn)包括腫瘤microRNA（microRNAs in cancer）、IL-17通路（IL-17 signaling pathway）、花生四烯酸代謝（arachidonic acid metabolism）、Th17細(xì)胞分化（Th17 cell differentiation）等。（見圖4）基于MCODE算法所識別靶點(diǎn)的富集分析結(jié)果，包括類泛素化修飾（SUMOylation）等，圖中4個紅點(diǎn)表示密切關(guān)聯(lián)的網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)。（見圖5、表1）

圖3 平消片治療胃癌靶點(diǎn)的GO富集分析

圖4 平消片治療胃癌靶點(diǎn)的KEGG富集分析

表1 基于MCODE算法識別的平消片抗胃癌靶點(diǎn)的富集分析

圖5 基于MCODE算法識別的密切關(guān)聯(lián)的平消片抗胃癌靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.3 平消片抗胃癌靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò) 平消片抗胃癌潛在靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)包含38個節(jié)點(diǎn)和128個連線。（見圖6）核心蛋白互作網(wǎng)絡(luò)顯示了平消片抗胃癌的核心靶點(diǎn)，包括PTGS2、AKT1、ESR1、NR3C1、AHR等。（見圖7）同時，基于38個抗胃癌靶點(diǎn)挖掘了20個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，包括JUN、SP1、RELA、ESR1、NR3C1等。（見圖8）

圖6 平消片抗胃癌靶點(diǎn)的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖7 平消片抗胃癌靶點(diǎn)的核心蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

圖8 與平消片抗胃癌靶點(diǎn)相關(guān)的20個關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子

2.4腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞浸潤豐度 核心靶點(diǎn)的基因表達(dá)水平與不同免疫細(xì)胞浸潤豐度之間的相關(guān)性分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果提示核心靶點(diǎn)PTGS2、ESR1、NR3C1的表達(dá)水平與腫瘤純度相關(guān)，核心靶點(diǎn)PTGS2、AKT1、ESR1、NR3C1、AHR的表達(dá)水平均與至少2種免疫細(xì)胞的浸潤豐度相關(guān)。（見圖9、表2）

圖9 平消片抗胃癌核心靶點(diǎn)與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性

表2 平消片抗胃癌核心靶點(diǎn)與免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)性的統(tǒng)計學(xué)意義

2.5 平消片抗胃癌靶點(diǎn)的臨床意義及預(yù)后價值 平消片抗胃癌靶點(diǎn)主成分分析結(jié)果表明，靶點(diǎn)的基因表達(dá)情況在胃癌組織與正常組織之間有區(qū)分。（見圖10）核心靶點(diǎn)在胃癌不同病理階段的基因表達(dá)情況，其中Pr（＞F）＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)果提示ESR1、NR3C1、AHR在胃癌不同病理階段表達(dá)有差異。（見圖11）核心靶點(diǎn)的表達(dá)與胃癌患者總生存期、無病生存期的關(guān)系分析[風(fēng)險比（hazard ratios，HR），LogrankP＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義]，結(jié)果提示PTGS2的表達(dá)與胃癌患者總生存期有相關(guān)性，ESR1、NR3C1的表達(dá)與胃癌患者總生存期、無病生存期有相關(guān)性。（見圖12）

圖10 基于腫瘤和正常組織的基因表達(dá)情況對平消片抗胃癌靶點(diǎn)進(jìn)行主成分分析

圖11 平消片抗胃癌核心靶點(diǎn)在不同病理階段的基因表達(dá)情況

圖12 平消片抗胃癌核心靶點(diǎn)對患者總生存期和無病生存期的預(yù)后價值

3 討 論

平消片組方具有攻堅(jiān)破積，解毒止痛、活血養(yǎng)血、健脾理氣之效[3]，在腫瘤相關(guān)疾病的臨床治療中應(yīng)用廣泛。研究結(jié)果提示，平消片的靶點(diǎn)涉及多種腫瘤疾病，如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、食管癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌等。同時，平消片的作用還涉及心理或情緒障礙，包括自閉癥、躁郁癥和抑郁癥等。腫瘤患者的心理痛苦是一個值得重視的問題，情緒調(diào)節(jié)是患者能夠恢復(fù)健康的重要因素[19]。中醫(yī)學(xué)自古就重視情志因素與疾病的關(guān)系，數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，平消片能發(fā)揮調(diào)節(jié)腫瘤患者心理情緒的作用。此外，平消片組方中含有中藥郁金，具有清心解郁的功效，在精神、神經(jīng)系統(tǒng)疾病等領(lǐng)域也有應(yīng)用[20-21]。

富集分析結(jié)果表明，平消片通過參與多個生物途徑發(fā)揮抗胃癌的作用。GO分析結(jié)果提示，平消片可以影響脂質(zhì)代謝過程（regulation of lipid metabolic process）、炎性反應(yīng)（regulation of inflammatory response）、細(xì)胞對外界刺激的反應(yīng)（cellular response to external stimulus）、對脂多糖的反應(yīng)（response to lipopolysaccharide）、透明質(zhì)酸代謝（hyaluronan metabolic process）、細(xì)胞衰老（aging）、淋巴細(xì)胞的活化（lymphocyte activation）、上皮細(xì)胞分化（epithelial cell differentiation）、氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）、絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）等。KEGG分析結(jié)果提示，平消片可以影響腫瘤microRNA（microRNAs in cancer）、IL-17通路（IL-17 signaling pathway）、花生四烯酸代謝（arachidonic acid metabolism）、Th17細(xì)胞分化（Th17 cell differentiation）等。MCODE分析結(jié)果提示平消片可以影響類泛素化修飾（SUMO ylation）。上述生物途徑和信號通路均與腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展有密切關(guān)系。如花生四烯酸代謝，在癌變過程中有重要作用，該途徑中的代謝酶磷脂酶A2s（PLA2s）、環(huán)氧化酶（COXs）和脂氧合酶（LOXs），以及代謝產(chǎn)物如前列腺素和白三烯，已被視作腫瘤防治的新靶點(diǎn)[22]。再如SUMO化修飾是一種可逆的翻譯后修飾，在調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和維護(hù)基因組完整性方面起著關(guān)鍵作用，廣泛參與了DNA損傷修復(fù)、腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等，也是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)[23]。

蛋白互作和核心靶點(diǎn)分析表明PTGS2、AKT1、ESR1、NR3C1、AHR等是平消片發(fā)揮抗胃癌作用的重要靶點(diǎn)。PTGS2（又稱COX-2）是花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素過程中的一種關(guān)鍵酶，有研究報道了PTGS2在腫瘤發(fā)生發(fā)展、血管生成和轉(zhuǎn)移中的作用，并與化療耐藥性密切相關(guān)[24]。AKT1是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶，在腫瘤細(xì)胞葡萄糖代謝、細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞遷移等多種生物過程中發(fā)揮作用[25]。ESR1（estrogen receptor 1）編碼雌激素受體α（ERα），該受體可通過多種途徑與其他信號分子相互作用，如PI3K/Akt或MAPK信號通路等。ESR1突變最早報道于乳腺癌，在胃癌中，其與細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)[26]。NR3C1在胃癌組織中甲基化程度較高，可能在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[27]，且有研究報道了該基因的表達(dá)與胃癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)[28]。AHR表達(dá)芳香烴受體（Aryl hydrocarbon receptor），是一種配體依賴性激活的核受體，有研究表明其可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖與侵襲[29]。此外，本研究基于平消片抗胃癌的靶點(diǎn)，挖掘了潛在的20個轉(zhuǎn)錄因子如JUN、STAT3、HDAC1、TP53、NFKB1、HIF1A等，其中ESR1、NR3C1等預(yù)測結(jié)果既是核心靶點(diǎn)，也是轉(zhuǎn)錄因子。平消片可以通過影響這些轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮抗胃癌作用。

富集分析結(jié)果提示平消片可以干預(yù)免疫細(xì)胞及炎性反應(yīng)，因此進(jìn)一步分析了腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞浸潤情況，結(jié)果表明核心靶點(diǎn)的差異表達(dá)水平分別與多種免疫細(xì)胞（B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突細(xì)胞）的豐度及腫瘤純度相關(guān)，這也佐證了富集分析的結(jié)果。免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中扮演著重要角色，其與腫瘤細(xì)胞相互影響，參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移。例如，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞可極化為M1型或M2型，其中M1型巨噬細(xì)胞具有較好的抗腫瘤能力，而腫瘤細(xì)胞分泌的多種因子可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化，同時，M2型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子也可以促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[30]。因此，調(diào)控巨噬細(xì)胞M2型向M1型轉(zhuǎn)化，是抑制腫瘤進(jìn)展的一個有效策略。

基于臨床樣本數(shù)據(jù)庫，靶點(diǎn)主成分分析的結(jié)果表明，平消片可以通過調(diào)控數(shù)據(jù)挖掘所得潛在靶點(diǎn)發(fā)揮治療胃癌的作用。核心靶點(diǎn)ESR1、NR3C1、AHR在胃癌不同病理階段基因表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且PTGS2、ESR1、NR3C1的差異表達(dá)與胃癌患者的臨床預(yù)后有相關(guān)性，因此，平消片也可以作用于這些核心靶點(diǎn)影響胃癌患者臨床預(yù)后。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，獲得了平消片治療胃癌的潛在靶點(diǎn)，富集分析結(jié)果表明平消片可以通過影響脂質(zhì)代謝、炎性反應(yīng)、免疫、花生四烯酸代謝、SUMO化修飾等多種生物途徑發(fā)揮抗胃癌功能，也可作用于PTGS2、AKT1、ESR1、NR3C1、AHR等核心靶點(diǎn)影響胃癌患者預(yù)后。平消片通過多途徑、多靶點(diǎn)發(fā)揮抗胃癌作用的預(yù)測分析結(jié)果，為進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù)和線索。