敷和湯對CUMS聯合孤養致抑郁模型大鼠的行為學及血清單胺類神經遞質的影響*

鄭若韻，賀 娟，熊為鋒，王 旭，韓 玲，郝 宇

（北京中醫藥大學中醫學院，北京 100029）

五運六氣理論是中醫學“天人合一”整體觀思想的集中體現。運氣理論認為疾病的發生受到天地氣化的影響，因此在診治疾病時應充分考慮運氣學特點。“三因司天方”是陳無擇根據運氣七篇大論中關于不同中運，不同司天在泉下的運氣特點，創立的16首針對每年易發疾病的方劑，后世應用于臨床，多有奇效，成為歷代醫家以運氣指導臨床用藥的代表。但是，目前關于運氣方的研究多為臨床個案驗案的報道[1-3]，動物實驗研究尚不多見，導致運氣方臨床療效的科學性難以證實，也限制了運氣方的應用推廣。

精神類疾病是發病率高、致殘率高、預后差的一類疾病，其中抑郁癥以其發病率高，對人生活、工作影響大，且存在部分嚴重抑郁患者自殺現象而備受關注[4-5]。探索其發病原因與治療措施，降低抑郁癥發病率，提高臨床療效，是醫學研究的重要內容。《素問》運氣七篇大論中記載了大量干支運氣與精神類疾病發生的相關性論述，如《素問·氣交變大論篇》曰：“歲木太過，風氣流行，脾土受邪，民病……忽忽善怒，眩冒巔疾。……歲火太過，炎暑流行，肺金受邪。民病……譫妄狂越。”《素問·五常政大論篇》言：“卑監之紀，是謂減化，……其主飄怒振發；……太陽司天，寒氣下臨，心氣上從，……喜悲數欠。”以上“善怒”“癲疾”“譫妄狂越”“飄怒振發”“喜悲數欠”等皆是精神疾病的癥狀表現。且有研究證實抑郁癥患者存在明顯的五運六氣稟賦特征[6]，抑郁癥發病具有明顯的五運六氣時間規律[7]。由此推測在運氣理論指導下創立的運氣方對于精神類疾病的治療可能有獨到的作用。而精神類疾病的動物模型中，也以抑郁癥的動物模型較理想而常用[8]。

因此本研究以抑郁癥為切入點，復制國際精神藥理學界公認的慢性不可預見性溫和刺激（Chronic unpredictable mild stress，CUMS）抑郁大鼠模型[9]，研究2019年（己亥年）運氣方敷和湯對抑郁模型大鼠的藥效作用，并與臨床療效確切的西藥氟西汀和中藥柴芩溫膽湯進行對比[10-11]，以期為運氣方的臨床使用提供科學依據，挖掘運氣理論對于臨床診療的重要指導價值。

1 材 料

1.1 實驗動物8周齡SPF級雄性SD大鼠40只，體質量180～220 g，購于北京斯貝福實驗動物技術有限公司，動物合格證號：11401500044296，動物許可證號：SCXK（京）2016-0002。飼養于北京中醫藥大學動物房（SPF級），實驗動物使用許可證號：SYXK（京）2016-0038。12 h晝夜循環，室溫恒定在22～24℃，相對濕度保持在55%～65%。本研究通過北京中醫藥大學動物倫理審查，審查編號：BUCM-4-2019030507-1046，動物的飼養和使用符合國際動物倫理法。

1.2 藥物 中藥飲片均購自北京同仁堂（亳州）飲片有限責任公司，經北京中醫藥大學中藥學院專家鑒定合格。敷和湯方劑組成：半夏15 g，五味子15 g，枳實15 g，茯苓30 g，干姜10 g，橘皮15 g，棗仁15 g，訶子10 g，炙甘草15 g。柴芩溫膽湯方劑組成：柴胡12 g，黃芩12 g，清半夏9 g，竹茹10 g，茯苓15 g，枳實12 g，陳皮15 g，炙甘草9 g。鹽酸氟西汀（Patheam France，禮來蘇州制藥有限公司分裝，批號：H20170003，規格：20 mg/粒）。敷和湯和柴芩溫膽湯復方按照傳統中藥煎煮方法水煎煮2次，每次30 min，合并煎液，水煎濃縮至200%（相當于生藥2 g/mL），4℃冰箱冷藏備用。鹽酸氟西汀膠囊臨用時用去離子水配成質量濃度為0.3 mg/mL的藥液。

1.3 試劑 單胺類神經遞質標準品：去甲腎上腺素（NE）（Sigma-Aldrich公司，批號：088K1147）；腎上腺素（E）（Sigma-Aldrich公司，批號：108K0930）；多巴胺（DA）（Sigma-Aldrich公司，批號：062426ED）；3，4-二羥基苯乙酸（DOPAC）（Sigma-Aldrich公司，批號：1364209 22509196）；高香草酸（HVA）（Sigma-Aldrich公司，批號：107K5002）；5-羥色胺（5-HT）（Sigma-Aldrich公司，批號：028K5152）；5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）（Sigma-Aldrich公司，批號：1413645 14608169）。內標：3，4-二羥芐胺（DHBA）（Sigma-Aldrich公司，批號：04429MO）。色譜級甲醇（Fisher，批號：186358）；L-半胱氨酸（Amresco公司，批號：20120928）；磷酸二氫鈉（Merck公司，批號：C10095211）；辛烷磺酸鈉（Alfa Aesar公司，批號：T23B035）；乙二胺四乙酸二鈉（Alfa Aesar公司，批號：G05R019）；氯化鉀（Alfa Aesar公司，批號：J23R026）；蔗糖（上海國藥試劑，批號：20190310，500 g/瓶）。

1.4 主要儀器Agilent 1100LC型高效液相色譜儀（美國Agilent，包括G1379A型脫氣機、G1311A型色譜泵、G1313A型自動進樣器、G1316A型柱溫箱）；DECADEⅡSDC型電化學檢測器[荷蘭ANTEC公司，包括玻璃碳工作電極、Ag/AgCl參比電極、工作站（Clarity CHS）]；Biofuge Stratos高速冷凍離心機（德國HERAEUS）；VCX130型超聲破碎儀（美國SONICS）。

1.5 分組與造模40只SD大鼠適應性飼養1周后，按照隨機數字表法隨機分為空白組、模型組、氟西汀組、柴芩溫膽湯組、敷和湯組，每組8只。空白組群養，8只/籠，自由攝食、飲水，不給予任何刺激，其余各組動物孤養，1只/籠，接受42 d造模刺激。采用CUMS聯合孤養方法建立抑郁大鼠模型[9]。CUMS：根據實驗室條件，選取以下7種溫和刺激。冰水游泳（4℃，5min）；束縛（3 h）；禁水（24 h）；禁食（24 h）；夾尾（1 min）；晝夜顛倒（顛倒晝夜順序，08:00:00—20:00:00模擬黑夜，20:00:00—08:00:00模擬白晝）；45°籠具傾斜（24 h）。為避免大鼠產生應激刺激的耐受性，造模期間，每天隨機施加一種刺激，每種應激不在連續的2 d內重復出現，7 d為1個周期。

1.6 實驗給藥 每天每只大鼠灌胃給藥量按照成人平均體質量60 kg換算成大鼠的等效藥物劑量（給藥量=成人劑量×6.17/60）。氟西汀組大鼠灌胃給予2.057 mg/kg氟西汀混懸液（去離子水溶解）；柴芩溫膽湯組大鼠灌胃給予9.667 g/kg柴芩溫膽湯；敷和湯組大鼠灌胃給予14.397 g/kg敷和湯，每7 d復測大鼠體質量1次，根據體質量變化更新灌胃劑量。氟西汀組、柴芩溫膽湯組、敷和湯組大鼠于造模后30～60 min灌胃給藥，空白組、模型組給予等量去離子水。每天固定時間灌胃，1次/d，連續給藥42 d。

1.7 觀測指標

1.7.1 大鼠一般情況 觀察大鼠皮膚毛發的色澤、枯榮，活躍程度，飲食情況，大小便狀態等。

1.7.2 糖水偏好實驗 在實驗開始前，訓練所有大鼠使其適應含1%蔗糖飲水。在糖水適應結束后應激刺激開始之前，進行糖水偏好基礎值的測試，每組選用最接近總糖水偏愛基礎值平均值的6只大鼠進行實驗，即篩除對糖水極端敏感或極端不敏感的個體，分別于實驗開始前1天（0 d）、實驗開始后第7天（7 d）、第14天（14 d）、第21天（21 d）、第28天（28 d）、第35天（35 d）、第42天（42 d）進行糖水偏好實驗[12]，記錄大鼠的糖水消耗、純水消耗、總液體消耗，并計算糖水偏好指數。糖水偏好指數=[（糖水消耗/總液體消耗）]×100%，比較分析各組大鼠在不同時間點糖水偏好指數的組間差異。

1.7.3 血清單胺神經遞質的測定 采用高效液相色譜-電化學檢測（HPLC-ECD）測定大鼠血清單胺類神經遞質NE、DA、5-HT的含量。在完成大鼠各項行為學檢測后，禁食24 h，用10%的水合氯醛，按照3 mL/kg的劑量，麻醉大鼠后，腹主動脈取血于采血管內，靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，取約1.5 mL上清液于進口2 mL尖頭EP管中，置于-80℃冰箱保存待測。

樣品前處理：每500 μL血清加入100 μL裂解液（1.3 mol/L高氯酸，0.04%L-胱氨酸，2.0 mmol/L EDTA-2Na），冰浴超聲破碎10 s。4℃、15 000 r/min離心30 min，取上清液-80℃凍存以析出蛋白，檢測前再以15 000 r/min離心30 min，取上清液用0.22 μm耐酸過濾器過濾，取20 μL檢測。

色譜條件：Skyam C18柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流動相：磷酸二氫鈉100 mmol/L，辛烷磺酸鈉0.74 mmol/L，乙二胺四乙酸鈉0.027 mmol/L，氯化鉀8 mmol/L，甲醇8%，pH值為3；流速：0.2 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10 μL；測定電極電勢：500 mV。檢測前額葉皮質、海馬、下丘腦單胺類神經遞質，包括去甲腎上腺素（NE）、5-羥色胺（5-HT）、5-羥吲哚乙酸（5-HIAA）、多巴胺（DA）及其代謝產物3，4-二羥基苯乙酸（DOPAC）、高香草酸（HVA）。

1.8 統計學方法 實驗數據采用SPSS 24.0軟件進行統計分析，計量資料以“均數±標準差”（±s）表示，符合正態分布和滿足方差齊性，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法；重復測量計量資料采用重復測量方差分析。不服從正態分布者用非參數檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。統計圖采用GraphPad Prism 7.0軟件進行繪制。

2 結 果

2.1 各組大鼠一般狀況 在實驗開始之前，各組大鼠生長狀態優良，行動靈活，二便、攝食飲水均正常。造模與給藥結束后，與空白組比較，模型組大鼠精神狀態極差，活動量明顯減少，膽小，易受驚嚇，常拱背蜷縮，皮毛枯黃無光澤，伴隨攝食減少，大便稀溏等現象；與模型組比較，氟西汀組、柴芩溫膽湯組和敷和湯組大鼠外觀表征好轉明顯，皮毛色澤明亮、細膩光滑，精神尚可，活動度明顯增加，攝食、飲水情況良好；大、小便情況尚可，總體情況接近空白組大鼠。柴芩溫膽湯組和敷和湯組大鼠活躍度提高較氟西汀組大鼠更為明顯，且柴芩溫膽湯組和敷和湯組大鼠組間差異不明顯。

2.2 糖水偏好實驗結果 實驗前（0 d）各組大鼠的糖水偏好指數比較，差異無統計學意義（P＞0.05），5組大鼠糖水偏好指數整體比較，差異有統計學意義（P＜0.01），即存在分組效應，造模及給藥結束后（42 d），與空白組比較，模型組大鼠糖水偏好指數明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，氟西汀組、柴芩溫膽湯組、敷和湯組大鼠糖水偏好指數明顯升高（P＜0.01）。所有大鼠不同時間點糖水偏好指數比較，差異有統計學意義（P＜0.01），即存在時間效應。分組因素和時間之間存在交互效應（P＜0.01），隨治療時間的延長，模型組大鼠糖水偏好指數總體呈下降趨勢，各治療組糖水偏好指數在21 d（敷和湯組在14 d）后均呈現明顯上升趨勢。（見表1、圖1）

表1 各組大鼠糖水偏好指數比較（±s，%）

表1 各組大鼠糖水偏好指數比較（±s，%）

注：F時間主效應=7.599，P時間主效應=0.000；F分組主效應=8.655，P分組主效應=0.000；F交互效應=1.858，P交互效應=0.019；與空白組比較，aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較，cP＜0.05，dP＜0.01

組別 動物數（只）給藥劑量(g/kg) 0 d 7 d 14 d 21 d 28 d 35 d 42 d F P空白組 6 - 85.69±9.35 80.85±12.01 93.85±6.12 75.40±23.7 83.65±7.56 88.72±7.15 88.09±5.68 0.688 0.662模型組 6 - 83.67±12.74 75.82±15.29 63.66±17.16a 59.04±18.36 56.19±18.33b 69.37±11.33a 49.93±14.75b 7.108 0.000氟西汀組 6 2.057×10-3 81.49±15.79 89.80±10.05 68.75±22.41 54.59±19.05 74.76±13.65c 91.42±4.28d 85.03±3.59d 3.859 0.010柴芩溫膽湯組6 9.667×10-3 76.90±9.39 81.36±13.40 77.49±23.39 56.51±15.06 75.67±10.93c 89.68±4.68c 85.89±5.57d 2.621 0.049敷和湯組 6 14.397×10-3 86.83±8.92 81.55±11.87 56.09±13.88b 68.3±19.74 76.77±14.05c 84.35±4.00 88.36±9.63d 3.743 0.012 F 0.695 0.945 4.007 1.239 3.510 10.227 21.304 P 0.602 0.454 0.012 0.320 0.021 0.000 0.000

圖1 糖水偏好指數時間和分組交互效應輪廓圖

2.3 各組大鼠血清單胺類神經遞質及其代謝產物水平比較

2.3.1 各組大鼠血清NE及其代謝產物E含量比較 與空白組比較，模型組大鼠血清E含量明顯降低（P＜0.05），NE含量有升高趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）；氟西汀組、柴芩溫膽湯組和敷和湯組大鼠血清NE、E含量與模型組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠血清NE及其代謝產物E含量比較（±s，ng/mL）

表2 各組大鼠血清NE及其代謝產物E含量比較（±s，ng/mL）

注：與空白組比較，aP＜0.05

組別 動物數（只） 給藥劑量(g/kg)NE E空白組 8 - 165.01±69.37 10.17±3.93模型組 8 - 178.79±65.35 6.24±2.01a氟西汀組 8 2.057×10-3 165.05±58.0 4.47±2.94柴芩溫膽湯組 8 9.667×10-3 215.94±72.46 6.18±2.81敷和湯組 8 14.397×10-3 189.22±45.57 5.87±3.12

2.3.2 各組大鼠血清DA及其代謝產物DOPAC、HVA含量比較 與空白組比較，模型組大鼠血清HVA含量明顯降低（P＜0.05），DA含量有明顯降低趨勢，DOPAC含量有升高趨勢，但差異均無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，柴芩溫膽湯組大鼠血清HVA含量明顯升高（P＜0.01），氟西汀組和敷和湯組大鼠DA、DOPAC、HVA與模型組比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠血清DA及其代謝產物含量比較（±s，ng/mL）

表3 各組大鼠血清DA及其代謝產物含量比較（±s，ng/mL）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01

?組別 動物數（只）給藥劑量(g/kg)DA DOPAC HVA空白組 8 - 2.23±1.95 3.33±1.70 79.3±19.02模型組 8 - 0.53±0.45 3.79±1.96 50.5±16.08a氟西汀組 8 2.057×10-3 0.66±0.61 3.64±1.42 50.43±15.7柴芩溫膽湯組8 9.667×10-3 0.70±0.55 3.23±1.24 74.04±15.62b敷和湯組 8 14.397×10-3 0.51±0.40 4.33±1.80 53.86±12.71

2.3.3 各組大鼠5-HT及其代謝產物5-HIAA含量比較 與空白組比較，模型組大鼠血清5-HT含量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，柴芩溫膽湯組、敷和湯組大鼠血清5-HT含量明顯升高（P＜0.01），柴芩溫膽湯組大鼠血清5-HIAA含量明顯升高（P＜0.01）。（見表4）

表4 各組大鼠血清5-HT及其代謝產物含量比較（±s，ng/mL）

表4 各組大鼠血清5-HT及其代謝產物含量比較（±s，ng/mL）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.01

組別 動物數（只）給藥劑量(g/kg) 5-HT 5-HIAA空白組 8 - 1 652.47±523.73 13.59±5.4模型組 8 - 1 001.84±403.62a 13.56±5.62氟西汀組 8 2.057×10-3 1 455.21±192.95 12.19±4.68柴芩溫膽湯組8 9.667×10-3 2 212.75±561.96b 20.07±3.62b敷和湯組 8 14.397×10-3 2 096.79±449.69b 17.20±2.09

3 討 論

本研究基于中醫運氣理論，觀察運氣方敷和湯對抑郁模型大鼠行為學和血清單胺類神經遞質及其代謝產物的影響。根據運氣理論，敷和湯適用于己亥之歲，厥陰風木司天，少陽相火在泉時段，全年木火之氣盛行[13]。方中半夏辛能潤下，合茯苓淡滲，祛濕除黃；棗仁生用瀉相火；甘草以緩厥陰，風在上，以酸甘瀉之，火在下，以五味子之咸制之；干姜溫右脅之冷；枳實以泄脾之濕；陳皮、訶子醒胃悅脾。本實驗于2019年（己亥年）開展，符合運氣理論所述敷和湯適用的運氣特點。實驗中同時設置陽性對照藥氟西汀及抗抑郁常用經典方劑柴芩溫膽湯作為對照，探究運氣情況對各方發揮抗抑郁療效的影響。

CUMS是目前較為公認的抑郁癥動物模型，聯合孤養建立的動物模型能夠穩定地模擬人類抑郁癥患者的核心癥狀，即快感缺失，且具有高度的有效性，基于此模型研究抑郁癥的病因學和抗抑郁藥的作用有重要的科學意義[14]。而快感缺失程度則常用經典行為學實驗糖水實驗進行評估[12]。本研究采用CUMS聯合孤養方法復制抑郁大鼠模型，結果表明經過6周的CUMS干預，模型組動物的糖水偏好指數明顯低于空白組（P＜0.01），快感缺乏，符合抑郁癥核心癥狀的主要表現，表明造模成功。實驗前（0 d），各組大鼠糖水偏好指數基線水平具有一致性，各組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。給藥結束后（42d），與模型組比較，氟西汀組、柴芩溫膽湯組、敷和湯組大鼠糖水偏好指數明顯升高（P＜0.01），說明3種藥物干預均具有改善抑郁癥狀的作用。

NE、DA、5-HT等單胺類神經遞質屬于中樞神經遞質，參與機體運動、睡眠、情感等活動的調節，對神經系統正常的生理功能的維持發揮重要作用[15-16]。單胺假說是比較公認的抑郁癥的發病機制，大腦中5-HT及NE濃度水平或功能下降是導致抑郁癥發生的生物學基礎，DA亦參與了抑郁癥的發病過程，因此提高單胺類神經功能，提升單胺類濃度，可以起到抗抑郁的治療效果[17]。本研究中給藥后，模型組大鼠血清E、HVA、5-HT含量均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。敷和湯則顯著提高了血清5-HT含量（P＜0.01），柴芩溫膽湯顯著提高了血清HVA、5-HT和5-HIAA的含量（P＜0.01）。已有研究表明，重度抑郁癥（MDD）患者的血清5-HT濃度明顯低于健康對照組[18]；抑郁患者血漿DA代謝產物HVA和DOPAC水平明顯降低[19]。本次實驗中血清5-HT等單胺類神經遞質水平的升高與抑郁行為改善的相關性也提示，血清5-HT及HVA可能在抑郁障礙的診斷和抗抑郁效果的判斷中發揮重要作用。柴芩溫膽湯作為抗抑郁常用經典方劑，已有實驗研究表明其能有效改善抑郁癥模型小鼠抑郁表現，增加模型小鼠腦組織中的5-HT含量[20]，本次實驗結果與之相補充，為驗證運氣方的療效提供有效對照。本次實驗中模型組NE含量與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

本研究結果表明，敷和湯改善抑郁癥狀的作用較顯著，其機制可能與上調大鼠血清5-HT含量有關。同時，一般情況觀測中敷和湯組和柴芩溫膽湯組的大鼠活躍度提高較氟西汀組大鼠更為明顯，而兩個中藥組間未觀察到明顯差異；柴芩溫膽湯組、敷和湯組大鼠糖水偏好指數均明顯升高（P＜0.01），敷和湯組大鼠糖水偏好指數高于柴芩溫膽湯組，但差異無統計學意義（P＞0.05），一定程度上說明改善抑郁癥狀的作用相當。我們據此推測實驗中復制的抑郁癥動物模型，其發病受到運氣的影響，結合運氣用藥的治療效果與常用經典方劑相當，提示了五運六氣對于疾病發生的影響，說明根據運氣特點指導臨床用藥有其現實意義。本研究僅對抑郁大鼠血清單胺神經遞質的變化進行了分析，未對上游相關通路進行深入探究，是本研究的局限性。