桃紅四物湯對大鼠肢體缺血-再灌注損傷骨骼肌Wnt5a信號表達的影響*

李武平，李 婕，易 南，黃思琦，劉宗義，朱付平

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，長沙 湖南 410007；2.湖南中醫藥大學，長沙 湖南 410208）

肢體缺血-再灌注損傷（limb ischemia-reperfusion injury，LIRI）是肢體缺血損傷和再灌注損傷的合稱，其常繼發于動脈損傷、動脈栓塞、斷肢再植、帶血管蒂組織移植、骨筋膜室綜合征、重建手術、不當止血帶應用等方面。自1985年Mc Cord提出缺血-再灌注損傷的概念后[1]，逐漸被學術界公認并不斷地深入研究，相較于對心、肝、腦、腎等重要器官缺血-再灌注損傷的研究方面，學術界對骨骼肌缺血-再灌注損傷的研究相對較少，然而骨骼肌對缺血十分敏感，文獻報道顯示阻斷肢體血流2.5 h后復灌就會引起肢體缺血-再灌注損傷[2]。LIRI可致肢體骨骼肌壞死攣縮而致殘，嚴重者甚至引起全身多器官功能衰竭而致死亡[3]。醫學界多認為其與脂質過氧化、氧自由基損傷、鈣離子代謝紊亂、細胞凋亡、炎癥反應損害等有關，但LIRI的分子病理機制尚不明確，亦缺乏特異并且有效的治療方法[4-5]。我們前期研究發現，Wnt/Ca2+信號通路在大鼠LIRI鈣離子代謝及炎癥反應方面起著至關重要的作用[6]。桃紅四物湯源自清代吳謙《醫宗金鑒》，是活血化瘀經典方劑之一，臨床上也常用于各種嚴重創傷所致潛在LIRI風險，并取得了滿意療效[7]。課題組前期研究顯示桃紅四物湯預處理可減少大鼠LIRI骨骼肌細胞凋亡[8]，同時體外細胞實驗研究發現，經缺氧再給氧誘導損傷的大鼠骨骼肌細胞中，Wnt5a、IP3R、CaMKⅡ等蛋白表達明顯上調，而桃紅四物湯預處理后可以通過調控Wnt/Ca2+信號通路Wnt5a/IP3R/CaMKⅡ途徑來減輕肢體缺血-再灌注損傷[9]。Wnt5a作為Wnt信號通路中重要的上游信號分子，在大鼠體內的表達變化情況值得進一步研究，因此本研究制備LIRI骨骼肌損傷大鼠模型，以Wnt5a阻滯劑作為陽性對照，觀察桃紅四物湯干預對Wnt5a表達變化的影響，從Wnt/Ca2+信號通路角度進一步探討大鼠LIRI骨骼肌損傷機制及桃紅四物湯的干預機制，旨在為豐富LIRI的病理機制和防治方法提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8周齡SPF級SD雄性大鼠100只，體質量（230±10）g，購自湖南長沙SLAC景達實驗動物有限公司，動物生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002，動物使用許可證號：SYXK（湘）2019-0002。大鼠在湖南中醫藥大學實驗動物中心的無病原體設施中常規飼料飼養，自由飲水，飼養環境為溫度20～25℃、相對濕度50%～70%，光照12 h。本實驗已通過湖南中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查，倫理審查批號：HN-LL-GZR-201609；動物福利按照國際相關實驗動物法規實施。

1.2 藥物與試劑 桃紅四物湯，方藥組成：桃仁15 g，紅花15 g，熟地黃10 g，赤芍10 g，當歸10 g，川芎10 g，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院制劑科結合現代工藝加工制成藥液，規格：250 mL/瓶，質量濃度：0.15 g/mL原料藥，批號：20160408；FZR5（美國Sigma公司，批號：20160206，規格：20 μg/mL）；0.25%胰蛋白酶-EDTA（北京索來寶科技有限公司，批號：T1350）；抗Wnt5a（北京博奧森生物技術有限公司，批號：BS4773）；Trizol[愛普拜斯應用生物系統貿易（上海）有限公司，批號：15596-026]；Rever Tra Ace qPCR RT試劑盒（東洋紡上海生物科技有限公司，批號：FSQ101）；SYBRPremix Ex TaqTM（perfect real-time）試劑盒（大連寶生物工程公司，批號：DRR420A）；大鼠IL-1β ELISA檢測試劑盒（批號：ab100772）、大鼠TNF-α ELISA檢測試劑盒（批號：ab100785）（英國Abcam公司）。

1.3 主要儀器GL16M臺式高速冷凍離心機（長沙科威實業有限公司，型號：TGL20M）；BD-180S雙門冷凍柜（青島海爾冰箱通用有限公司，型號：BC/BD-318HD）；NIS Elements F3.0軟件（日本東京尼康，型號：AR/BR/D）；Image Pro plus version 6.0（美國Media Cybernetics公司）；酶標儀（上海培奧分析儀器有限公司，型號：PO-9622A）；7500實時PCR擴增儀（美國ABI公司，型號：7500）。

1.4 動物分組與造模 將100只SD大鼠按隨機數字表法分為正常組、模型組、桃紅四物湯低劑量組、桃紅四物湯高劑量組、阻滯劑組，每組20只。除正常組大鼠不阻斷血流外，其他4組均根據課題組前期造模方法[10]，用塑料套管和市售橡皮筋阻斷SD大鼠右后肢血流4 h后，再解除阻斷恢復下肢血流灌的注，制備大鼠肢體缺血-再灌注損傷模型；阻斷大鼠后肢血流4 h后，大鼠趾掌變得蒼白青紫、發涼，擠壓足趾無毛細血管充盈反應，患肢主動活動明顯受限，被動牽拉患肢大鼠掙扎躲避，提示造模成功。

1.5 實驗給藥 桃紅四物湯低、高劑量組大鼠于造模前3 d開始灌胃給予桃紅四物湯，2次/d，造模前2 h再給藥1次，每只大鼠給藥共7次，具體給藥劑量根據所測體質量通過體表面積-劑量換算法，計算得出大鼠每天桃紅四物湯的等效劑量為1.35 g/kg，FZR5大鼠的等效劑量為87 μg/kg；桃紅四物湯低、高劑量分別設置為等效劑量的1、2倍，即桃紅四物湯低劑量組大鼠每日給藥劑量為1.35 g/kg，桃紅四物湯高劑量組為2.70 g/kg，阻滯劑組在造模前2 h予以腹腔注射FZR5，87 μg/kg；正常組和模型組大鼠在同樣的時間點給予相同體積蒸餾水灌胃。

1.6 觀察指標 在缺血再灌注0、2、4、8 h 4個時間點，各組隨機選取5只大鼠，3%戊巴比妥鈉（1.5 mL/kg）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，仰臥位固定在自制大鼠手術臺上，右側后肢相應的區域剪毛，復合碘消毒，沿右側后肢長軸方向依次切開皮膚、皮下組織、深筋膜，充分顯露腓腸肌肌腹組織，切取腓腸肌100 mg，迅速冰鹽水洗凈血液，濾紙吸干水分，剪刀切割剪碎后裝入保存管，置于低溫冰箱（-70℃）保存。

1.6.1 HE染色法行組織病理學觀察 取復灌后8 h大鼠部分腓腸肌組織切片，用4%中性甲醛溶液固定，石蠟切片（4 μm）蘇木精染液染色，0.5%冰鹽酸-酒精分化液分化，梯度酒精脫水，50%伊紅液染色，梯度酒精脫水、二甲苯使切片透明后晾干，中性樹膠封片，蓋片，顯微鏡下觀察各組大鼠腓腸肌病理損傷情況并拍照記錄。

1.6.2 ELISA法檢測腓腸肌IL-1β、TNF-α含量 取不需要組織學檢查的部分腓腸肌組織，轉移到勻漿機中，暴露于蛋白質提取液中，在冰浴下勻漿，移入離心管中，15 000 r/min離心30 min，除去沉淀，取上清液于-20℃下保存，分析。取100 μL的樣品，參考TNF-α、IL-1β ELISA試劑盒操作步驟，在酶標儀上進行檢測，取波長450 nm，空白孔校零后，讀取各孔OD值。

1.6.3 RT-qPCR法檢測腓腸肌Wnt5a mRNA表達 使用Trizol試劑盒、氯仿和異丙醇等試劑，完成總RNA的提取、清洗、溶解、定量及鑒定；用寡核苷酸18引物和M-MLV逆轉錄酶逆轉錄2 μg總RNA以獲得cDNA，以cDNA為模板，以GAPDH為內參，根據溶解曲線證實引物的特異性和結果的可信度，使用2-ΔΔCT測定靶基因的相對表達量。其中ΔCt=目的基因Ct-內參基因Ct，ΔΔCt=對照組ΔCt-樣品組ΔCt。引物序列見表1。

表1 基因RT-qPCR引物信息

1.6.4 免疫組化法檢測腓腸肌Wnt5a蛋白的陽性表達 提取復灌后8 h的大鼠腓腸肌組織，多聚甲醛固定并切片，3%過氧化氫（H2O2）處理，并與10%山羊血清預孵育，然后與抗Wnt5a（1∶100）抗體在4℃孵育后，用HRP標記的IgG孵育樣品，用二氨基聯苯胺（DAB）進行顯色反應，在顯微鏡下觀察顯色過程。使用NIS Elements F 3.0軟件在200倍放大的光學顯微鏡下觀察顯色過程并采集圖像。用Image Pro plus version 6.0單盲法測量Wnt5a陽性表達處的積分光密度（IA）值。

1.7 統計學方法 數據應用SPSS 21.0軟件包進行統計分析，計量資料采用“均數±標準差”（±s）表示，IL-1β、TNF-α、Wnt5a mRNA表達數據為符合正態分布及方差齊的計量資料，采用重復測量資料方差分析；Wnt5a蛋白表達數據為符合正態分布及方差齊的計量資料，采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠腓腸肌病理結果比較 本實驗所有大鼠在觀察時間窗內均無死亡，正常組大鼠可見腓腸肌肌纖維呈長索狀，肌纖維排列整齊，結構清晰，肌漿豐富，每一肌纖維內表面有多個緊密附著的細胞核，胞核大小均勻，著色均勻；模型組大鼠可見腓腸肌肌纖維紊亂、腫脹，大部分肌纖維完整性、連續性遭到破壞，細胞核散在稀疏，肌纖維間明顯炎癥細胞浸潤；阻滯劑組、桃紅四物湯低劑量組、桃紅四物湯高劑量組大鼠大部分腓腸肌肌纖維結構完整、排列整齊，部分肌纖維輕度破壞變薄，部分肌纖維間縫隙增寬，少量炎癥細胞浸潤。（見圖1）

圖1 各組大鼠腓腸肌染色形態光鏡圖（HE，×100）

2.2 各組大鼠腓腸肌中IL-1β含量比較 不同再灌注時間（0、2、4、8 h）之間大鼠腓腸肌中IL-1β含量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），不存在時間效應。模型組大鼠腓腸肌中IL-1β含量呈逐漸上升的趨勢，再灌注8 h達到峰值（P＜0.05）；桃紅四物湯低劑量組大鼠腓腸肌中IL-1β含量呈逐漸下降的趨勢，再灌注8 h為最低值（P＜0.05）；阻滯劑組大鼠腓腸肌中IL-1β含量呈先升高后降低，然后再升高的變化趨勢，再灌注2 h達到峰值（P＜0.05）。5組大鼠腓腸肌中IL-1β含量總體比較，差異有統計學意義（P＜0.05），即存在分組效應。模型組大鼠腓腸肌中IL-1β含量高于正常組（P＜0.05）；阻滯劑組、桃紅四物湯低劑量組、桃紅四物湯高劑量組大鼠腓腸肌中IL-1β含量均低于模型組（P＜0.05）；桃紅四物湯高劑量組大鼠腓腸肌中IL-1β含量均低于桃紅四物湯低劑量組（P＜0.05）；桃紅四物湯高劑量組大鼠腓腸肌中IL-1β含量低于阻滯劑組（P＜0.05）。時間因素與分組因素間存在交互效應（P＜0.05）。（見表2、圖2）

表2 各組大鼠腓腸肌中IL-1β含量比較（±s，pg/mL）

表2 各組大鼠腓腸肌中IL-1β含量比較（±s，pg/mL）

注：F交互效應=16.088，P交互效應=0.000；F時間主效應=0.921，P時間主效應=0.434；F組別主效應=3412.524，P組別主效應=0.000；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與桃紅四物湯低劑量組比較，cP＜0.05；與阻滯劑組比較，dP＜0.05

組別 動物數（只） 給藥劑量[g/(kg·d)]0 h 2 h 4 h 8 h F P正常組 5 - 134.26±1.65 134.03±3.69 136.83±5.66 137.53±9.27 1.249 0.298模型組 5 - 256.06±5.87a 261.13±3.26a 270.18±0.99a 272.17±3.81a 22.662 0.000桃紅四物湯低劑量組5 1.35 218.53±0.72ab 213.94±1.21ab 208.36±3.04ab 197.96±2.43ab 30.845 0.000桃紅四物湯高劑量組5 2.70 181.47±2.89abcd 183.85±2.06abcd 187.37±2.24abcd 185.55±0.64abcd 2.473 0.068阻滯劑組 5 8.70×10-5 202.53±0.32ab 206.94±3.10ab 195.98±2.88ab 200.95±2.56ab 8.045 0.000 F 800.653 844.414 900.202 915.520 P 0.000 0.000 0.000 0.000

圖2 IL-1β的交互效應輪廓圖

2.3 各組大鼠腓腸肌中TNF-α含量比較 不同再灌注時間（0、2、4、8 h）之間大鼠腓腸肌中TNF-α含量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），即存在時間效應，5組均如此。正常組、模型組大鼠腓腸肌中TNF-α含量再灌注后逐漸上升，再灌注4 h達到峰值，然后均呈下降趨勢（P＜0.05）；桃紅四物湯低劑量組大鼠腓腸肌中TNF-α含量呈逐漸下降的趨勢，再灌注8 h為最低值（P＜0.05）；桃紅四物湯高劑量組大鼠腓腸肌中TNF-α含量呈逐漸升高的趨勢，再灌注8 h達到峰值（P＜0.05）；阻滯劑組大鼠腓腸肌中TNF-α含量再灌注后逐漸下降，再灌注2 h達到最低值，然后呈上升趨勢，再灌注8 h達到峰值（P＜0.05）。5組大鼠腓腸肌中TNF-α含量總體比較，差異有統計學意義（P＜0.05），即存在分組效應。模型組大鼠腓腸肌中TNF-α含量高于正常組（P＜0.05）；桃紅四物湯低劑量組、桃紅四物湯高劑量組、阻滯劑組大鼠腓腸肌中TNF-α含量均低于模型組（P＜0.05）；桃紅四物湯高劑量組大鼠腓腸肌中TNF-α含量低于桃紅四物湯低劑量組（P＜0.05）；桃紅四物湯高劑量組大鼠腓腸肌中TNF-α含量低于阻滯劑組（P＜0.05）。時間因素與分組因素間存在交互效應（P＜0.05）。（見表3、圖3）

表3 各組大鼠腓腸肌中TNF-α含量比較（±s，pg/mL）

表3 各組大鼠腓腸肌中TNF-α含量比較（±s，pg/mL）

注：F交互效應=17.067，P交互效應=0.000；F時間主效應=11.319，P時間主效應=0.000；F組別主效應=2202.912，P組別主效應=0.000；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與桃紅四物湯低劑量組比較，cP＜0.05；與阻滯劑組比較，dP＜0.05

組別 動物數（只） 給藥劑量[g/(kg·d)]0 h 2 h 4 h 8 h F P正常組 5 - 78.95±0.53 81.58±1.43 82.85±0.72 81.58±0.36 4.253 0.008模型組 5 - 125.30±0.41a 128.99±6.86a 134.45±2.53a 131.47±1.67a 23.725 0.000桃紅四物湯低劑量組5 1.35 112.32±0.32a b 109.17±0.67a b 106.57±0.71a b 102.11±0.85a b 29.451 0.000桃紅四物湯高劑量組5 2.70 86.29±055a b c d 88.22±0.37a b c d 91.73±0.19a b c d 93.83±0.56a b c d 18.228 0.000阻滯劑組 5 8.70×10-5 101.84±0.19a b 101.71±0.38a b 103.07±0.38a b 105.11±0.97a b 3.929 0.011 F 562.483 548.380 605.970 537.279 P 0.000 0.000 0.000 0.000

圖3 TNF-α的交互效應輪廓圖

2.4 各組大鼠腓腸肌Wnt5a mRNA表達比較 不同再灌注時間（0、2、4、8 h）之間大鼠腓腸肌Wnt5a mRNA表達比較，差異有統計學意義（P＜0.05），即存在時間效應。除正常組外，其余各組大鼠再灌注后腓腸肌Wnt5a mRNA表達均逐漸上升。5組大鼠腓腸肌Wnt5a mRNA表達總體比較，差異有統計學意義（P＜0.05），即存在分組效應。與正常組比較，模型組、阻滯劑組、桃紅四物湯高劑量組、桃紅四物湯低劑量組大鼠腓腸肌中Wnt5a mRNA表達上調（P＜0.05）；與模型組比較，阻滯劑組、桃紅四物湯高劑量組、桃紅四物湯低劑量組大鼠腓腸肌中Wnt5a mRNA表達下調（P＜0.05）；與桃紅四物湯低劑量組比較，桃紅四物湯高劑量組大鼠腓腸肌中Wnt5a mRNA表達下調（P＜0.05）；與阻滯劑比較，桃紅四物湯高劑量組大鼠腓腸肌中Wnt5a mRNA表達下調（P＜0.05）。時間因素和組別因素存在交互效應（P＜0.05）。（見表4、圖4～5）

表4 各組大鼠腓腸肌Wnt5a mRNA表達比較（±s）

表4 各組大鼠腓腸肌Wnt5a mRNA表達比較（±s）

注：F交互效應=8.209，P交互效應=0.000；F時間主效應=73.943，P時間主效應=0.000；F組別主效應=555.844，P組別主效應=0.000；與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與桃紅四物湯低劑量組比較，cP＜0.05；與阻滯劑組比較，dP＜0.05

組別 動物數（只） 給藥劑量[g/(kg·d)]0 h 2 h 4 h 8 h F P正常組 5 - 28.53±0.16 28.92±0.95 28.72±0.58 27.92±1.22 0.680 0.567模型組 5 - 41.56±1.56a 43.42±1.37a 45.36±1.12a 49.34±1.26a 40.342 0.000桃紅四物湯低劑量組5 1.35 38.13±1.17ab 40.36±1.23ab 42.63±0.89ab 45.16±1.15ab 33.138 0.000桃紅四物湯高劑量組5 2.70 36.83±1.31abcd 38.61±1.72abcd 40.32±0.93abcd 42.73±1.84abcd 10.158 0.000阻滯劑組 5 8.70×10-5 37.32±1.07ab 39.26±1.22ab 40.87±1.36ab 43.18±1.27ab 22.461 0.000 F 84.295 108.692 148.226 239.257 P 0.000 0.000 0.000 0.000

圖4 Wnt5a mRNA的交互效應輪廓圖

圖5 各組Wnt5a/GAPDH的擴增與溶解曲線圖

2.5 各組大鼠腓腸肌Wnt5a蛋白表達比較 模型組大鼠腓腸肌Wnt5a蛋白表達明顯高于正常組（P＜0.05）；阻滯劑組、桃紅四物湯低劑量組、桃紅四物湯高劑量組大鼠腓腸肌Wnt5a蛋白表達明顯低于模型組（P＜0.05）；桃紅四物湯高劑量組大鼠腓腸肌Wnt5a蛋白表達明顯低于桃紅四物湯低劑量組（P＜0.05）；桃紅四物湯高劑量組大鼠腓腸肌Wnt5a蛋白表達與阻滯劑組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見圖6、表5）

圖6 各組大鼠腓腸肌Wnt5a蛋白表達（IHC，×200）

表5 各組大鼠腓腸肌Wnt5a蛋白表達比較（±s）

表5 各組大鼠腓腸肌Wnt5a蛋白表達比較（±s）

注：與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與桃紅四物湯低劑量組比較，cP＜0.05；與阻滯劑組比較，dP＞0.05

組別 動物數（只） 給藥劑量[g/(kg·d)]Wnt5a表達積分光密度值（IA值）正常組 5 - 9.10±0.94模型組 5 - 28.36±2.65a桃紅四物湯低劑量組5 1.35 17.82±1.38ab桃紅四物湯高劑量組5 2.70 13.45±1.75abcd阻滯劑組 5 8.70×10-5 12.55±2.05ab F 96.337 P 0.000

3 討 論

LIRI的機理極為復雜，就目前的研究成果看，肢體缺血-再灌注損傷的病理機制是能量代謝障礙、興奮性神經遞質毒效應、鈣超載等導致組織細胞結構和功能障礙，以及引發大量自由基和一些促炎性細胞因子爆發釋放，如NF-κB、IL-1β、TNF-α等，從而引起全身炎癥反應[4]。中醫學中雖無“LIRI”病名的記載，但根據其病變的臨床表現（主要為腫脹、疼痛、組織壞死等），以及目前對骨筋膜室綜合征、斷肢再植術后、動脈栓塞等肢體缺血-再灌注損傷疾病的中醫病因病機分析和認知，LIRI當屬于“股腫”“脈痹”等范疇，病機多集中在瘀血內阻，氣血運行不暢等方面，證屬“氣滯血瘀”，而治則以“通行血脈”“化瘀消腫”為法。桃紅四物湯為活血化瘀的代表方，方中桃仁、紅花活血化瘀；熟地黃、當歸甘溫，滋補肝腎之陰，養血調經，通達氣機；川芎行氣活血，調暢氣血，以助活血之功，使氣行以達血行[11]。全方以活血化瘀為主，配合滋補肝腎，條達氣機，行氣活血，消腫止痛，使瘀血祛，新血生，共奏氣通、血活、腫消、痛減之功效。因而，桃紅四物湯廣泛應用于缺血-再灌注損傷疾病的防治，如桃紅四物湯能夠抑制腦缺血-再灌注損傷后大鼠大腦皮質神經元Caspase-3與p53的表達，從而減輕腦細胞的凋亡[12]；也有學者[13]從基因傳導通路方面證實桃紅四物湯對大鼠腦缺血-再灌注損傷具有保護作用。在腎臟缺血-再灌注損傷方面，桃紅四物湯可通過抗氧化作用改善缺血-再灌注大鼠腎臟功能[14]；在肢體缺血-再灌注損傷疾病方面，有研究顯示桃紅四物湯加減可改善四肢骨折術后患者血清炎癥因子水平，減輕四肢骨折肢體腫脹程度，可有效預防骨筋膜室綜合征形成[7]；有學者使用桃紅四物湯干預家兔早期骨筋膜室綜合征模型，發現桃紅四物湯能上調早期骨筋膜室綜合征模型家兔血清SOD含量，抑制氧自由基的過度生成，降低血中CK、LDH、AST含量,從而改善骨骼肌細胞損傷，防止骨筋膜室綜合征這一惡性循環進行性加重[15]。本課題組從2009年開始觀察桃紅四物湯治療肢體缺血性疾病的療效，療效頗佳，并根據處方中各藥物所含有效成分的理化性質，采用水提、減壓及濃縮制成中成藥桃紅四物湯，便于保存，使用更為方便，在我院廣泛運用，取得了很好的效果。前期動物實驗顯示其可以提高肢體缺血-再灌注損傷大鼠血清SOD的濃度，降低MDA濃度，減少氧自由基產生，減輕過氧化反應從而減輕肢體缺血-再灌注損傷[16]。但目前桃紅四物湯對LIRI骨骼肌保護作用的分子機制尚不明確。

隨著醫學研究的深入，近年來國內外學者對LIRI的病理機制研究及防治重心逐漸深入至分子機制水平和信號因子靶向調控方面[5]。Wnt信號通路是一條繁雜的信號網絡，在機體生長、發育、代謝、免疫、應激等多種生理過程中發揮著重要作用，Wnt5a是Wnt家族中具有代表性的Wnt蛋白，主要來源于巨噬細胞的效應分子，通過自分泌和旁分泌發揮作用，近年來廣泛受到關注，其既能作用于經典的Wnt/β-catenin通路，又能活化非經典的Wnt/Ca2+通路。其中Wnt5a/Ca2+信號通路的異常參與了許多疾病如腫瘤、炎癥、代謝性等疾病發生和發展[17]，Wnt5a可介導不同的受體參與調節不同的Wnt信號轉導通路，并最終導致不同的結果，最常見的受體為卷曲蛋白（Frizzled受體，Fz）受體，當Wnt5a信號與胞膜上Fz受體結合時，將膜磷脂（PIP2）水解，生成第二信使IP3和二酰基甘油（DG），由此激活Wnt/Ca2+信號通路，一方面通過IP3-Ca2+信號通路促進Ca2+大量釋放，DG-PKC通路抑制Ca2+吸收從而導致細胞內Ca2+濃度持續升高，形成惡性循環導致鈣超載，最終誘導細胞凋亡[18]；另一方面通過Wnt5a/Fz5-IP3R-CaMKⅡ信號途徑和Wt5a/Fz5-DG-PKC-MAPK途徑，誘導分泌IL-6、IL-8、MIP-1β、TNF-α等炎癥因子釋放，其中TNF-α既能促進NF-κB表達，又依賴NF-κB反作用于巨噬細胞，促進細胞自分泌Wnt5a，由此Wnt5a/Ca2+通路與炎癥信號途徑組成了繁雜的網絡系統，二者聯系密切又交互影響，Wnt5a/Ca2+通路的失衡會導致炎癥應答的紊亂，從而誘發一系列炎癥反應[19]。

課題組前期實驗結果顯示，桃紅四物湯適宜劑量[1.35、2.70 g/（kg·d）]對預處理大鼠LIRI骨骼肌具有保護作用，并且呈量效關系，而過高桃紅四物湯劑量[5.4 g/（kg·d）]不僅未出現理想的量效關系，反而加重骨骼肌損傷[8]。因此本實驗設計以1.35、2.70 g/（kg·d）劑量為桃紅四物湯低、高劑量。本研究HE染色顯示模型組可見肌纖維紊亂、腫脹，大部分肌纖維完整性、連續性遭到破壞，細胞核散在稀疏，肌纖維間明顯炎性浸潤，提示造模成功。研究顯示阻滯劑組，桃紅四物湯低、高劑量組大鼠腓腸肌中IL-1β、TNF-α含量明顯低于模型組，說明阻滯劑、桃紅四物湯預處理可抑制炎癥反應從而達到減輕LIRI作用。RT-qPCR和IHC結果顯示，與正常組比較，LIRI各組中Wnt5a蛋白及其mRNA表達均一致性上調，差異均有統計學意義（P＜0.05）。鑒于Wnt5a在Wnt信號通路中信號分子屬性[17]，以及Wnt5a與炎癥信號在炎癥性疾病中的交叉互動作用[19]，這提示Wnt5a可能是LIRI中的關鍵蛋白，LIRI中骨骼肌Wnt5a表達上調，可激活Wnt信號通路從而介導骨骼肌細胞凋亡和炎癥反應。與模型組比較，阻滯劑組，桃紅四物湯低、高劑量組中Wnt5a蛋白及其mRNA表達一致性下調，而桃紅四物湯低、高劑量組，阻滯劑組中Wnt5a蛋白及其mRNA表達比較，差異無統計學意義（P＜0.05），說明LIRI經桃紅四物湯預處理后，Wnt5a的表達下調，起到類似Wnt5a阻滯劑效應，在一定程度上抑制因LIRI所激活的Wnt5a信號通路，通過抑制炎癥反應、減少細胞凋亡從而達到減輕LIRI作用，這和本課題體外實驗研究結果一致[9]。本研究表明，時間因素和組別因素對IL-1β、TNF-α以及Wnt5a mRNA表達的影響存在交互效應，提示在肢體缺血-再灌注損傷早期，骨骼肌損傷的病理變化進行性進展，早期及時應用有效藥物濃度干預有利于減輕這一病理過程，這為LIRI骨骼肌細胞損傷的分子機制和桃紅四物湯的防治作用提供了實驗證據。

本研究中桃紅四物湯低、高劑量組IL-1β、TNF-α炎癥因子水平下降高于同一時間點阻滯劑組，差異有統計學意義（P＜0.05）。我們推測這可能與引起LIRI的復雜的分子病理機制有關，鑒于Wnt5a是眾多Wnt家族中的一員，以及中藥多環節、多途徑、多靶點效應，桃紅四物湯在抑制LIRI炎癥反應方面可能存在多途徑、多靶點效應，這值得我們進一步深入研究。