膝骨關節炎特異性自身抗體的表達對淋巴細胞凋亡的影響

張強，張敏，黃志榮，王高，胡中立，章智華

江西中醫藥大學附屬洪都中醫院，江西 南昌 330006

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是于老年人群中高發的慢性疾病之一，退行性病理改變是KOA 的發病基礎，膝關節腫痛、彈響以及坐立走行膝關節都活動不便為患者的一般癥狀表現，KOA 病情嚴重會發展成膝關節的嚴重障礙甚至是畸變，嚴重影響患者身心健康、自理能力以及加重家庭負擔［1-3］。臨床認為，肥胖所致膝關節壓力過大及磨損、膝骨外傷以及機體過勞都是導致KOA 疾病的主要原因［4］。如今，人口肥胖率升高，KOA 患病率也升高，所以，加強KOA 的防治措施，對于患者以及社會都有著十分積極的意義［5］。而目前醫學界對于該病診斷治療尚且沒有特異性和有效率都較高的辦法，通過減輕關節磨損緩解病情是臨床的主要應對措施［6］。為了提高患者的治療體驗及效果，無創生化指標來測評KOA 病情以及預后逐漸成為學術界爭相研究的一大熱點［7］。相關研究顯示，角蛋白（AKA）、核周因子（APF）以及瓜氨酸（anti-CCP）抗體等三種特異性自身抗體在KOA 患者空腹血中的表達較正常人出現異常，而臨床研究表明KOA疾病的發生發展與淋巴細胞凋亡出現異常存在關系［8］。因此本研究旨在研究AKA、APF 以及anti-CCP 抗體等三種特異性自身抗體對KOA 細胞凋亡影響,為KOA 患者提供診斷和治療思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2018年3 月至2019年10 月期間江西中醫藥大學附屬洪都中醫院收治的82 例KOA 患者為研究組，招募82 例健康志愿者為對照組。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性，詳見表1。參試者及近親屬簽署了試驗知情同意書，本研究符合醫學倫理原則要求。

表1 研究組和對照組一般資料比較

1.2 入選標準

納入標準：（1）研究組患者符合KOA 臨床診斷標準；（2）對照組無關節疾病。排除標準：（1）合并腫瘤；（2）類風濕性關節炎以及除KOA 以外的其他關節性疾病；（3）免疫系統及其他內科疾病患者；（4）精神病患者。

1.3 KOA 嚴重程度分組標準

根據Kellgren-Law-rence（K-L）標準分級，膝關節檢測正常為0 級；膝關節有微小骨質增生現象為Ⅰ級；膝關節間隙窄，輕度骨贅為Ⅱ級；膝關節骨贅變多骨質硬化為Ⅲ級；膝關節骨贅大量增多、骨質嚴重硬化畸變，伴隨關節的不同程度脫位為Ⅳ級。將KOA 患者分為KOA 輕、中、重度三個亞組，0～Ⅰ級為輕度組；Ⅱ級為中度組；Ⅲ～Ⅳ級為重度組。

1.4 檢測特異性自身抗體

IIF 法:抽取患者清晨空腹靜脈血，離心分離取上清，經過稀釋后若所測抗體呈陽性，繼續稀釋，直到測定最終稀釋度，測定過程按IIF 試劑盒說明嚴格操作。ELISA 法：首先對各組血清進行稀釋，全程反應60 min，待反應結束后讀取吸光度值，采用直線回歸計算樣本濃度，陽性標準為100 U/mL及以上，試劑盒均來自北京博爾邁生物科技有限公司，過程按相應的試劑盒操作說明書。

1.5 檢測淋巴細胞凋亡率

抽取的各組靜脈血首先采用肝素抗凝血，然后分離T、B 淋巴細胞。將細胞于FCM 管低溫PBS 液洗滌、離心、棄上清，再加入緩沖液，血細胞分析儀進行細胞計數，再使用搖床混勻，PI 染料進行避光染色，流式細胞儀檢測細胞凋亡，并記錄凋亡細胞占所有細胞的比率，具體數值以百分數形式表示。所涉及的儀器來自美國貝克曼公司。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 各亞組分組情況及資料

如表2，根據K-L 分級標準將研究組KOA 患者 分 為KOA 輕 度 組27 例，KOA 中 度 組36 例，KOA 重度組19 例。四組在男女比例、年齡以及BMI 水平均差異無統計學意義（P>0.05）。

表2 各亞組分組情況及資料

2.2 各組特異性自身抗體的表達比較

如下圖1，通過對比對照組和研究組KOA 患者血清中特異性自身抗體AKA、APF 以及anti-CCP的表達：研究組中三者的表達較對照組顯著上調（P<0.05）。不同嚴重程度分組比較：與輕度組比較，中、重度組患者血清中AKA、APF、anti-CCP 的相對表達顯著升高（P<0.05）。，見表3。

表3 對照組及KOA病情不同嚴重程度亞組中的表達比較（）

表3 對照組及KOA病情不同嚴重程度亞組中的表達比較（）

注：a表示與對照組比較，P<0.05；b表示與KOA輕度組比較，P<0.05；c表示與KOA中度組比較，P<0.05。

圖1 對照組及研究組血清中特異性自身抗體的表達

2.3 各組T、B 淋巴細胞凋亡率結果比較

與對照組比較，KOA 輕度組患者的T、B 淋巴細胞凋亡率較對照組有降低的趨勢，差異無統計學意義（P>0.05）；KOA 中、重度組患者T、B 淋巴細胞凋亡率較輕度組顯著降低（P<0.05），見圖2和表4。

圖2 T、B淋巴細胞凋亡流式細胞圖

表4 對照組及KOA病情不同嚴重程度亞組淋巴細胞凋亡率比較（%，）

表4 對照組及KOA病情不同嚴重程度亞組淋巴細胞凋亡率比較（%，）

注：a表示與對照組比較，P<0.05；b表示與KOA輕度組比較，P<0.05；c表示與KOA中度組比較，P<0.05。

2.4 特異性自身抗體對KOA 的診斷價值

如表5、圖3 所示，ROC 曲線分析的結果顯示：特異性自身抗體AKA、APF 以及anti-CCP 對KOA均具有良好的診斷價值。

表5 特異性自身抗體與KOA病情程度ROC曲線分析結果

圖3 特異性自身抗體與KOA病情程度ROC曲線分析

2.5 影響因素分析

logistic 回歸分析結果：血清特異性自身抗體AKA、APF、anti-CCP 均是影響KOA 患者病情程度的獨立危險因素（P<0.05）。，見表6。

表6 影響KOA病情的Logistic回歸分析

2.6 特異性自身抗體與淋巴細胞凋亡率的相關性分析

相關性分析結果顯示：特異性自身抗體AKA、APF 以及anti-CCP 與淋巴細胞凋亡率均呈負相關（R<0，P<0.05）。其中AKA 與B、T 淋巴細胞負相關（R=-0.633，-0.498，P<0.05）；APF 與B、T 淋巴細胞負相關（R=-0.478，-0.654，P<0.05）；anti-CCP 與B、T 淋巴細胞負相關（R=-0.553，-0.378，P<0.05）。見圖4。

圖4 特異性自身抗體與淋巴細胞凋亡率的相關性分析

3 討論

KOA 又被稱作膝關節增生性關節炎，該病不但發病率高，且預后效果不佳病情遷延難愈，因此該病的臨床關注度高［9］。對該病治療會根據患者病情的輕重程度針對性進行，對于病情較輕患者，康復鍛煉以維持膝關節能力；對于病情較重者，采用向關節腔內注射藥物治療；而對于膝關節以及產生嚴重畸變，關節基本功能喪失則需要進行膝關節置換術及相關手術治療，而且痊愈的可能性很低［10］。因此，尋找在疾病早期準確檢測治療的方法十分重要［11］。醫學研究表示：外來抗原使機體自身產生免疫抵抗，該抗原將HLA-DR 分子呈遞給吞噬細胞加工，從而激活機體的T 淋巴細胞，導致KOA。特異性自身抗體是指抗自身抗原的一類免疫球蛋白［12］。相關臨床問診和病歷分析AKA、APF、anti-CCP 與KOA 患者關節壓痛數以及晨僵時間等疾病相關指標有關，說明其與KOA 病情程度和活動性相關，而臨床研究表明KOA 疾病的發生發展與淋巴細胞凋亡出現異常存在關系［13-15］。機體淋巴細胞的凋亡關系到機體免疫系統的正常運轉以及能否發揮正常生物學作用［16］，因此探究KOA 患者特異性自身抗體的表達對機體淋巴細胞凋亡的影響有著十分重要的臨床意義。

本研究通過IIF 法聯合ELISA 法測定AKA、APF、anti-CCP 等特異性自身抗體在KOA 不同病情患者中的表達，分析KOA 特異性自身抗體與T、B 淋巴細胞凋亡率的相關性。KOA 患者中AKA、APF、anti-CCP 表達較健康者顯著上調（P<0.05）。與KOA 輕度組比較，KOA 中度患者血清中三種特異性自身抗體表達顯著升高（P<0.05），KOA 重度患者極顯著升高（P<0.05）。結果提示：特異性自身抗體AKA、APF 以及anti-CCP 的相對表達隨著KOA 患者病情嚴重程度的加重呈梯度依賴性上升。KOA 中度組患者較KOA 輕度患者的T、B 淋巴細胞凋亡率顯著降低（P<0.05），KOA 重度組患者極顯著降低（P<0.05）。推測KOA 患者的病情程度加重與機體淋巴細胞的正常凋亡受到阻滯存在相關。ROC 診斷曲線結果表明，特異性自身抗體AKA、APF 以及anti-CCP 對于KOA 均具有良好的診斷價值。Logistic 分析顯示：血清特異性自身抗體AKA、APF、anti-CCP 均是影響KOA 患者病情程度的獨立危險因素（P<0.05）。相關性分析的結果表明，特異性自身抗體AKA、APF 以及anti-CCP 與T、B淋巴細胞凋亡率均呈負相關。其中AKA 與B、T 淋巴細胞負相關；APF 與B、T 淋巴細胞負相關；anti-CCP 與B、T 淋巴細胞負相關。KOA 患者血清特異性自身抗體的表達越高，淋巴細胞的凋亡率就越低。本研究對于結果的論述進行了多層次的對比以及相關數據的處理。然而，依然存在其不足之處：由于試驗時間的關系，納入的患者樣本容量不夠大，可能會對研究結果產生一定的影響。后續研究可擴充樣本繼續分析。

綜上所述，KOA 患者血清特異性自身抗體的表達越高，淋巴細胞的凋亡率越低，血清特異性抗體水平與KOA 的發生密切相關，參與了KOA 的發病過程，反映了KOA 病情輕重及關節損傷程度，所以KOA 患者血清特異性表達對于KOA 的疾病診斷及病情提示都有一定的臨床價值。