基于COⅠ基因的滆湖鲌類國家級水產種質資源保護區3種鲌類的遺傳多樣性分析

李大命 劉洋 唐晟凱 劉燕山 蔣琦辰 何浩然 沈冬冬 張彤晴

摘要：為探究滆湖鲌類國家級水產種質資源保護區主要保護對象3種鲌類遺傳資源狀況，利用線粒體DNA COⅠ基因序列評價3種鲌類的遺傳多樣性及種群歷史動態。通過PCR技術和測序技術，獲得長度為630 bp COⅠ基因片段。序列分析結果表明，3種鲌類COⅠ基因序列堿基組成相似，且具有明顯堿基組成偏向性，A+T的含量高于G+C的含量。翹嘴鲌的46條COⅠ基因片段發現4個變異位點，定義了4種單倍型（Hq1-Hq4），翹嘴鲌的單倍型和核苷酸多樣性指數分別為0.422和0.00 085;蒙古鲌的20條COⅠ基因片段發現4個變異位點，定義4種單倍型（Hm1-Hm4），蒙古鲌的單倍型和核苷酸多樣性指數分別為0.695和0.001 90;達氏鲌的41條COⅠ基因片段發現4個變異位點，定義5種單倍型（Hd1-Hd5），達氏鲌的單倍型和核苷酸多樣性指數分別為0.230和0.000 53。中性檢驗和歧點分布分析顯示，3種鲌類在歷史進化過程中經歷了不明顯的種群擴張。整體來看，滆湖鲌類國家級水產種質資源保護區3種鲌類的遺傳多樣性水平較低，種群遺傳組成趨于單一化，需要采取措施增加鲌類種群數量，提高其遺傳多樣性水平。

關鍵詞：國家級水產種質資源保護區;遺傳多樣性;COⅠ基因;翹嘴鲌;蒙古鲌;達氏鲌

中圖分類號：S917.4;S931?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）20-0177-05

收稿日期：2021-04-08

基金項目：江蘇省水生生物資源重大專項暨首次水生野生動物資源普查（編號：ZYHB16-3）;2019年淡水漁業資源監測（編號：2019-SJ-018-2）;2020年漁業生態監測（編號：2020-SJ-016-2）。

作者簡介：李大命（1981—），男，河南省汝南人，博士，副研究員，主要從事大水面漁業資源監測和評估研究。E-mail：ldm8212@126.com。

國家級水產種質資源保護區是依法予以特殊保護和管理的水產種質資源主要生長繁殖區域，以實現水產種質資源及其生存環境的保護和合理利用，水產種質資源保護區的建立對于保護水產種質資源起到重要作用[1]。多年來，受氣候變化、過度捕撈、環境污染、工程建設的影響，水產種質資源保護區的生態環境及主要保護對象受到巨大威脅，亟待開展水產種質資源遺傳狀況的研究和保護[2]。滆湖鲌類國家級水產種質資源保護區位于江蘇省常州市武進區西南處滆湖水域的北端，保護區面積為1 520 hm2，其中核心區面積509 hm2，實驗區面積1 011 hm2。保護區特別保護期為全年，主要保護對象為翹嘴鲌（Culter alburnus）、蒙古鲌（Culter mongolicus）及達氏鲌（Culter dabryi）。迄今，尚無有關于保護區保護對象3種鲌類遺傳狀況的研究。

遺傳多樣性是評價物種資源狀況的一個重要指標，是物種適應周圍環境變化、維持生存和進化的物質基礎[3]。因此，掌握物種的遺傳多樣性和遺傳結構是開展生物種質資源保護和利用的前提和基礎。魚類的線粒體基因組是一種雙鏈DNA分子，具有分子小、結構簡單、編碼效率高、母系遺傳、重組率低、進化速率快等特點，已成為群體遺傳學和系統學研究的重要分子標記[4-5]。COⅠ基因是位于線粒體DNA的蛋白質編碼基因，其長度適宜，進化速度適中又相對保守，被廣泛應用于魚類物種鑒定及群體遺傳學領域，研究結果為認識魚類種質遺傳資源提供了重要依據[6-9]。

本研究利用線粒體DNA的COⅠ基因序列，首次探討滆湖鲌類國家級水產種質資源保護區主要保護對象的遺傳多樣性及遺傳結構，研究結果可為掌握3種鲌類的種質資源遺傳狀況、科學保護及合理利用水產種質資源提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和處理

2019年7—11月和2020年5月、9月，在滆湖鲌類國家級自然保護區開展漁業資源調查。采用三層刺網采集魚類樣本，魚類鑒定依據《江蘇魚類志》[10]。共采集翹嘴鲌46尾，蒙古鲌20尾，達氏鲌41尾，測定樣本體長與體質量。現場剪取樣本的肌肉組織，置于無水乙醇中保存，帶回實驗室用于提取基因組DNA。

1.2 DNA提取、PCR和測序

采用廣譜性基因組提取試劑盒提取肌肉組織基因組DNA。利用瓊脂糖凝膠電泳檢驗DNA完整性及紫外分光光度計測定DNA濃度。

COⅠ基因擴增引物為F1：5′-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3′和R1：5′-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3′[11]。COⅠ基因的PCR體系為50.0 μL，其中，含有10×PCR Buffer （含 20 mmol/L Mg2+）5.0 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.4 μL，dNTP（各2.5 mmol/L）4.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，DNA 模板1.0 μL（80 ng/μL），剩余體積用超純水補足。PCR程序為：94 ℃預變性4 min;94 ℃變性40 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，進行30個循環;最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

利用瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢驗，將合格的PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行雙向測序。

1.3 序列分析

使用BioEdit7.05.3軟件[12]讀取序列并輔以人工校對，利用Clustal X1.83軟件[13]進行多序列比對。采用MEGA 7.0軟件[14]計算堿基組成、變異位點及保守位點，計算種內及種間的遺傳距離，采用鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建3種鲌類單倍型的分子系統發育樹。利用DnaSP 6.0軟件[15]確定單倍型種類和個數，計算單倍型多樣性指數（h）和核苷酸多樣性指數（π），并進行Tajimas D和Fus Fs中性檢驗。

2 結果

2.1 COⅠ基因序列堿基組成

經比對和分析，獲得3種鲌類COⅠ基因片段，長度為630 bp，無堿基插入或缺失。翹嘴鲌4種堿基A、T、G、C的平均含量分別為26.0%、28.3%、18.0%和27.7%。同樣，蒙古鲌4種堿基的平均含量分別為25.8%、27.3%、18.2%和28.7%，達氏鲌4種堿基的平均含量分別為26.3%、28.7%、17.6%和27.4%。由表1可知，3種鲌類的堿基組成相近，堿基G的含量最低，堿基A+T含量高于 G+C 含量，表現出明顯堿基偏向性，其中，達氏鲌的A+T含量（55.0%）最高，蒙古鲌的A+T含量（53.1%）最低。

2.2 群體遺傳多樣性

由表2可知，翹嘴鲌46條COⅠ基因序列有4個變異位點，其中，1個是單一信息位點，3個是簡約信息位點，定義4種單倍型，單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.422和0.000 85;蒙古鲌20條 COⅠ 基因序列有4個變異位點，全部是簡約信息位點，定義4種單倍型，單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.695和0.001 90;達氏鲌41條COⅠ基因序列有4個變異位點，其中，3個是單一信息位點，1個是簡約信息位點，定義5種單倍型，單倍型多樣性和核苷酸多樣性分別為0.230和0.005 3。整體來看，3種鲌類的遺傳多樣性較低，其中蒙古鲌遺傳多樣性最高，達氏鲌遺傳多樣性最低。

翹嘴鲌群體有4種單倍型（Hq1～Hq4）組成，其中，單倍型Hq2數量最多，有34個，占群體比例為73.9%，單倍型Hq4有2個，單倍型Hq1和Hq3各有1個;蒙古鲌群體有4種單倍型（Hm1～Hm4）組成，單倍型Hm2數量最多，有10個，占群體的比例為50.0%，單倍型Hm1和Hm4各有4個，單倍型Hm3有2個;達氏鲌群體有5種單倍型（Hd1～Hd5）組成， 單倍型Hd1數量最多，有36個，占群體的比達87.8%，單倍型Hd4有2個，單倍型Hd2、Hd3和Hd5各有1個。

2.3 種內和種間遺傳距離

3種鲌類的種內遺傳距離均為0.000～0.005，翹嘴鲌和達氏鲌的種內遺傳距離均值為0.001，蒙古鲌的種內遺傳距離均值為0.002。3種鲌類的種間遺傳距離為0.031～0.043，其中，蒙古鲌和達氏鲌間的遺傳距離最大，蒙古鲌和翹嘴鲌之間的遺傳距離最小。種內遺傳距離均小于2%，種間遺傳距離為種內遺傳距離的15.5～43.0倍（表3）。

2.4 分子系統發育

以鯉（Cyprinus carpio，MK843657.1）為外類群，基于NJ法構建鲌類的分子系統發育樹，并應用Bootstrap（重復次數1 000）檢驗聚類樹各分支置信度。由圖1可知，3種鲌類均單獨聚為獨立分支，且節點的置信度水平較高，翹嘴鲌分支的支持率為99%，蒙古鲌和達氏鲌的分支支持率為100%，表明COⅠ基因可作為鲌類鑒定的有效分子標記[8]。同時可看出，達氏鲌和翹嘴鲌最先聚集在一起，然后與蒙古鲌聚集在一起，表明達氏鲌和翹嘴鲌的親緣關系較近，與蒙古鲌的親緣關系較遠，與王偉的研究結果[16]一致。

2.5 群體進化歷史

由表4可知，利用DnaSP 6.0對3種鲌類進行Tajiams D和FuFs中性檢驗，結果表明，3種鲌類的中性檢驗值均為負值，但統計結果不顯著（P>0.1）。由圖2可知，3種鲌類的歧點分布圖中，歧點分布曲線呈明顯的單峰型。

3 討論

3.1 3種鲌類的遺傳多樣性

通常采用單倍型多樣性指數（h）和核苷酸多樣性指數（π）2個常用參數衡量物種遺傳多樣性的高低，h和π值越大，表明群體的遺傳多樣性越豐富[17]。本研究采用COⅠ基因片段，首次分析滆湖鲌類國家級水產種質資源保護區主要保護對象的遺傳多樣性。結果顯示，翹嘴鲌、蒙古鲌和達氏鲌的單倍型多樣性分別為0.422、0.695和0.230，核苷酸多樣性分別為0.000 85、0.001 90和0.000 53。Grant和Bowen通過研究，將魚類的單倍型多樣性指數和核苷酸多樣性指數大小的閾值分別設定為0.5和0.005[18]。本研究結果表明，3種鲌類中只有蒙古鲌的單倍型多樣性大于0.5，表明保護區3種鲌類的遺傳資源較為貧乏。與三峽庫區翹嘴鲌（h：0.972 2～0.990 5，π：0.002 4～0.014 1）、蒙古鲌（h：0.866 7～1，π：0.002 2～0.002 4）、達氏鲌（h：0.969 0～1.000 0，π：0.033 0～0.071 5）[19]、長江中下游5個達氏鲌地理群體（h：0.412 3，π：0.001 1）[20]及長江流域湖北段和江蘇段5個蒙古鲌群體（h：0.664，π：0.002）[21]的遺傳多樣性相比，同樣表明保護區3種鲌類的遺傳多樣性指數較小。多年來，滆湖環境污染嚴重，藍藻水華頻繁發生，水生植物消失，涉水工程項目建設較多，加之過度捕撈等多種不利因素的影響，導致保護區魚類的棲息

環境被破壞，魚類的小型化、低齡化趨勢加劇，種群資源量下降，遺傳多樣性喪失[22-25]。另外，受水利工程建設的影響，滆湖處于相對封閉狀態，與周邊水體的魚類群體基因交流受阻，進一步導致滆湖魚類種質資源遺傳多樣性下降[26]。

一般來說，魚類的遺傳多樣性特征與進化歷史密切相關。Grant和Bowen根據單倍型多樣性和核苷酸多樣性的關系，將群體遺傳多樣性分為4種模式：第一類模式為低h和低π（h<0.5，π<0.005），表明種群近期經歷了瓶頸效應;第二類模式為高h和低π（h≥ 0.5，π<0.005），表示是受瓶頸效應后群體數量的迅速擴張導致;第三類模式為低h和高π（h<0.5，π ≥ 0.005），表示群體經歷了輕微的瓶頸效應，但沒有影響到核苷酸變異;第四類模式為高h和高π（h≥ 0.5，π≥0.005），表示群體穩定且具有比較悠久的進化歷史[18]。本研究結果顯示，翹嘴鲌和達氏鲌的單倍型多樣性<0.5，核苷酸多樣性<0.005，屬于第一種類型;蒙古鲌單倍型多樣性>0.5，核苷酸多樣性<0.005，屬于第二種類型，這表明3種鲌類近期均經歷了瓶頸效應，群體尚未有足夠長的時間積累遺傳變異。3種鲌類的中性檢驗結果顯示，Tajimas D 值和Fus Fs值均為負值，但統計結果不顯著，表明進化過程中偏離了中性選擇，發生輕微的有害突變或有害突變被清除[27-28]。3種鲌魚的歧點分布圖呈現單峰型[29]，綜合來看，表明3種鲌魚進化歷史上經歷了不明顯的種群擴張過程。

3.2 3種鲌類的遺傳結構

Hebert等基于COⅠ序列，對動物界11個門、13 320 個物種進行了研究，結果顯示，種內遺傳距離多在2%以下[30]。本研究結果顯示，翹嘴鲌、蒙古鲌和達氏鲌的種內遺傳距離均為0.000～0.005，明顯<2%，這說明在保護區內3種鲌類群體是一個自由交配的群體，群體內個體間存在廣泛的基因交流。從單倍型組成來看，特定類型的單倍型在群體中占據明顯優勢，翹嘴鲌的優勢單倍型Hq2有34個，占群體的比例為73.9%，蒙古鲌的優勢單倍型Hm2有10個，占群體的比例為50%，達氏鲌的優勢單倍型Hd1有36個，占群體的比例為87.8%，說明3種鲌類群體的遺傳組成趨于單一化，這可能由于鲌類的群體數量較小，受遺傳漂變的影響所致[31]。從保護生物學的角度來看，數量較少的單倍型容易丟失，對種群的遺傳多樣性產生較大影響，更需要加大保護力度。

3.3 鲌類種質資源保護

本研究顯示，種質資源保護區的3種鲌類遺傳多樣性水平較低，種群遺傳組成單一化，需要采取措施保護和修復鲌類資源，提高遺傳多樣性水平：（1）控制環境污染，治理藍藻水華，改善魚類的棲息環境;（2）構建水域生態牧場和建設人工魚巢，為繁殖和孵化提供基質和空間;（3）開展增殖放流，補充魚類資源量，優化魚類遺傳結構;（4）強化執法，嚴厲打擊非法捕撈，保護魚類繁殖和生長。

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