殘緣璃眼蜱玻片標本硼砂卡紅染色試驗

陸 靜，李琳潔，阿麗雅，高珍珍

（內蒙古農業大學獸醫學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

蜱蟲和蚊子都屬于節肢動物，在分類學上蜱蟲被列為蜱螨目下的蜱亞目，最后歸屬于蜱總科，蜱科又分為三個科，分別是納蜱科、軟蜱科和硬蜱科[1-2]。硬蜱類的蜱蟲是最常見且對人和家畜危害性最大的一類[3-4]。 殘緣璃眼蜱（Hyalomma detritum），硬蜱科璃眼蜱屬的一種蜱蟲，國內主要分布在黑龍江、吉林、遼寧和內蒙古等省、自治區[5-6]。現階段最普遍的蜱種分類方式是運用顯微鏡和解剖鏡對其進行形態學鑒定，找到蜱蟲最具特征性部位與《中國經濟昆蟲志》比對，來確定被檢蜱蟲的種類。目前，參考資料里用于區分不同蜱蟲具有特征性的部位包括假頭基、須肢、生殖孔、肛溝、盾板、孔區、足基節和氣門板等，然后根據其有無、形狀的不同、大小、長短和位置等來進行判別[7-8]。本試驗探索研究了殘緣璃眼蜱玻片標本硼砂卡紅染色方法，建立了一種快速、簡單、方便，標本清晰度高、對比性強、狀態易于識別的染色條件，為制作高質量的殘緣璃眼蜱玻片標本提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗所需殘緣璃眼蜱蟲體，取自內蒙古農業大學獸醫學院寄生蟲標本室保存的標本。

1.2 試劑和儀器

蓋玻片、載玻片、量筒、染色缸、三角瓶、挑蟲針、研缽、中性樹膠、丁香油、硼砂、卡紅、乙醇、福爾馬林和氫氧化鈉，其中試劑均為國產分析純。

顯微鏡（蔡司遠東有限公司，PRIMOSTAR）、水浴鍋（金壇市鑫鑫實驗儀器有限公司，HH-1）、恒溫培養箱 （上海一恒科學儀器有限公司，DHP-9011）、天平（上海佑科儀器儀表有限公司，YP5002）。

1.3 試劑配制

硼砂卡紅染色液配制：將硼砂研磨后，制備成4%的硼砂水溶液，取100 mL該溶液加入1g研磨充分的卡紅，并在水浴鍋中加熱至卡紅完全溶解后，再加入100 mL70%的乙醇，靜置24 h后，將硼砂卡紅染色液過濾后放入棕色瓶中備用。

1%酸酒精配制：將1 mL的鹽酸溶于99 mL70%乙醇中。

巴氏液配制：將8 g Nacl溶于30 mL福爾馬林中，加蒸餾水至1000 mL。

1.4 玻片標本制作方法

蟲體前處理：將10%的NaOH水溶液煮沸數分鐘。對于較大的蟲體，需要用昆蟲針在蟲體上刺些小孔，以利于蟲體內部組織的溶出，將蟲體置于溶液中，加熱直至蟲體內部的肌肉和內臟被溶解排出，蟲體軟化透明為止。取出蟲體置于清水中洗去堿液。清洗時要注意輕輕壓擠蟲體，使內容物排凈或把蟲體置于吸水紙上，輕輕壓擠，使內容物排出后被吸水紙吸附，再將蟲體置于清水中清洗。

染色：將清洗好的蟲體分別置于100%硼砂卡紅染液、90%硼砂卡紅染液、80%硼砂卡紅染液、70%硼砂卡紅染液、60%硼砂卡紅染液和50%硼砂卡紅染液中24 h。

脫水：染色后的蟲體在30%、40%、50%、60%和70%的乙醇中各脫水45 min，移入酸酒精中脫色30 s，取出蟲體放入70%乙醇中沖洗，洗去蟲體周圍浮色，然后將蟲體移入各級乙醇（80%、90%、95%、100%）中繼續脫水1 h。

透明：將無水乙醇中的蟲體挑出后，移入無水乙醇和丁香油原液比例為1:1的透明液中透明30 min，再用丁香油原液透明1 h。

封片：用挑蟲針輕輕挑取透明后的蟲體放在已洗凈的載玻片上，距離磨砂面約2.5 cm處，用挑蟲針調整蟲體位置，然后在蟲體處滴加適量中性樹膠，用蓋玻片封片，將制備好的玻片平放在載玻片架上，將其放入37℃溫箱中直至排凈氣泡，取出后室溫陰干。

2 結果

100%硼砂卡紅染液 （圖1）、90%硼砂卡紅染液（圖2）、80%硼砂卡紅染液（圖3、圖4）、70%硼砂卡紅染液（圖5）、60%硼砂卡紅染液（圖6）、50%硼砂卡紅染液（圖7）和不染色（圖8）。試驗結果顯示，經80%硼砂卡紅染液染色過夜，制作殘緣璃眼蜱玻片標本結構清晰，顏色鮮亮，染色后蟲體整體為粉紅色，假頭和軀體界限分明。

圖1 100%硼砂卡紅染液（40×）

圖2 90%硼砂卡紅染液（40×）

圖3 80%硼砂卡紅染液（40×）

圖4 80%硼砂卡紅染液

圖5 70%硼砂卡紅染液（40×）

圖6 60%硼砂卡紅染液（40×）

圖7 50%硼砂卡紅染液（40×）

圖8 蟲體不染色（40×）

經80%硼砂卡紅染液染色后，假頭和軀體界限分明,假頭的一對須肢細長由四節組成，每一節纖毫畢現；一對螯肢，位于兩腳須之間，呈長桿狀（圖9）。軀體后緣的緣垛凸凹有致（圖10）；四對足，每只足由六節組成，分別為基節、轉節、股節、脛節、前跗節和跗節（圖11）；足末端的爪和爪墊結構清晰、形態生動（圖12）；哈氏器位于第一對足的跗節近端部的背緣上，呈泡腔狀（圖13）；雄蜱腹面的肛門、肛側板和副肛側板，后端的肛下板層次分明；雌蜱氣門板往往呈逗點狀，雄蜱氣門板多為曲頸瓶狀，具有窄而長的背突（圖14）。

圖9 螯肢和腳須（100×）

圖10 緣垛（40×）

圖11 足（40×）

圖12 爪和爪墊（200×）

圖13 哈氏器（100×）

圖14 肛門、肛側板和副肛側板（40×）

3 討論

蜱可傳播多種病原，包括細菌、病毒和原蟲等，其中一些病原具有人獸共患的特點，對人類和畜牧業生產危害極大。全球共有蜱類3科907種，硬蜱科約700種，軟蜱科約200種，我國已描述定名的有2科10屬125種，其中硬蜱科111種，軟蜱科14種[9]，其分布廣泛，生活習性各異，應根據不同蜱種的生物學特性，因地制宜，采用相應的防制措施，才能取得良好的效果。一種好的蜱種鑒定方法是有效防制措施的前提。

目前，傳統形態學的鑒定方法和分子生物學手段都能運用到蜱蟲的鑒定中，但對一些科研條件不允許的地方，傳統形態學的鑒定方法就顯得十分重要。本試驗通過優化蜱蟲硼砂卡紅染液方法，借助解剖鏡觀察,并參考《中國經濟昆蟲志》，根據蜱蟲形態學的描述對蜱蟲進行鑒定[10]。蜱蟲形態學鑒定時，將蟲體染色，在染色過程中染液不宜過濃。若提高稀釋倍數而延長染色時間，染色的效果反而更佳。稀釋染液時，所用液體的含水量盡量與固定液的含水量相同或接近。本次試驗將硼砂卡紅染液原液按80%稀釋，染色24 h后，蟲體染色均勻，結構清晰，顏色鮮亮。

助色基團中具有酸性或堿性基團的染料分別稱為酸性或堿性染色劑0。卡紅粉末溶解于酸性或堿性溶液中才可以染色，兩種卡紅染液分別為醋酸卡紅染液、硼砂卡紅溶液0，其中以醋酸為溶劑的染液滲透作用快，染色后蟲體結構清晰，染色標本不易褪色，但可能存在染色不均勻的現象；卡紅以硼砂為溶劑進行染色，標本在制作完成后顏色質地均勻，不會出現染色過于濃郁的缺點。

本試驗相較于其他標本的制作方法，其制成的玻片標本可以長期保存且不易褪色；玻片標本攜帶方便，便于老師教學示范；制作方便簡易，不需要密封轉盤、封片機等，有利于條件較差的基層工作者進行診斷鑒定；一次制作，反復使用，解決了教學資源緊缺的問題，節約試驗材料，且便于學生觀察。殘緣璃眼蜱染色標本的制作方法有很多種，其中卡紅染色方法操作簡單，可重復性高，經濟實惠，實用性高；該觀察方法簡便易于實施，且可以滿足研究者的基本觀察需要，尤其是在基層單位實驗條件較差時也可以使用，更利于該方法的推廣，使用更加具有普遍性。

4 結論

經80%硼砂卡紅染液染色過夜，制作殘緣璃眼蜱玻片標本結構清晰，顏色鮮亮，染色后蟲體整體為粉紅色，假頭和軀體界限分明，且玻片標本可長時間保存。