犬免疫介導性溶血性貧血的診治

于靜茹，牛婉瑩，米潔，韓永榮，馬新武，盧德章*

（1.西北農林科技大學動物醫學院，陜西 楊凌 712100； 2.西北農林科技大學西安動物醫院，陜西 西安）

犬免疫介導性溶血性貧血（Immune-mediated hemolytic anemia，IMHA），又稱自身免疫性溶血性貧血（Autoimmune hemolytic anemia，AIHA），是由免疫介導性機制導致紅細胞加速破壞，進而引起貧血的一種臨床綜合征。IMHA是犬溶血性貧血常見病因之一，患犬常表現高度溶血和貧血，死亡率可達21%～83%[1]。2019年11月本院接診一例因注射疫苗導致的IMHA，本文結合該病例及多篇文獻對IMHA的發病機理、臨床癥狀、診斷、治療和預后進行了回顧性分析，旨在為犬IMHA治療提供臨床指導。

1 發病情況

11歲雄性邊境牧羊犬，未去勢，體重35 kg。該犬2019年10月注射過狂犬疫苗，2019年11月12日開始出現嘔吐、小便色黃、飲水減少、食欲逐漸下降等癥狀。2019年11月17日來到西北農林科技大學西安動物醫院就診。就診第一天，該犬精神沉郁，趴臥不動，小便呈棕紅色（圖1），可視黏膜蒼白，舌色蒼白，體溫39.9 ℃，心率128次/min，呼吸88次/min，腹部 觸診未見其他明顯異常。

圖1 小便顏色

2 初步診斷

初步懷疑為巴貝斯蟲感染、免疫介導性溶血性貧血，做CBC、血涂片、犬巴貝斯蟲PCR和吉氏巴貝斯蟲PCR、尿常規和血清生化檢查。2019年11月17日血涂片檢查結果：焦蟲未見，紅細胞大小不一，球形紅細胞（+++），自體凝集（+）（圖2）。2019年11月17日PCR檢查結果：犬巴貝斯蟲（-）；吉氏巴貝斯蟲（-）。

圖2 血液涂片結果

3 診斷結果

根據病史調查、臨床癥狀、尿常規、血常規、血涂片、生化檢查及尿液檢測，診斷為犬免疫介導性溶血性貧血。

4 治療

為緩解脫水使用糖生理鹽水40 ml/kg，靜脈注射；控制炎癥反應，應用頭孢曲松25 mg/kg，靜脈注射和拜有利5 mg/kg，肌肉注射；為控制免疫反應，應用潑尼松2 mg/kg，口服；為預防血管內凝血，應用肝素注射液100 IU/kg，靜脈推注。

表1 血常規檢查結果

表2 2019年11月17日尿常規檢查結果

2019年11月18日，患犬體溫恢復正常（38.6 ℃），精神尚可，尿顏色變黃，口色稍紅潤，少量進食，未見嘔吐。狀態好轉，治療方案同第一天。

表3 2019年11月17日血清生化檢查結果

2019年11月19日，患犬精神狀態、飲食良好，尿色接近正常，口色紅潤。治療方案同前2 d。

2020年11月20日，患犬病情顯著好轉，吃喝正常，食欲良好，精神狀態尚佳。當天出院，繼續使用潑尼松2 mg/kg，口服；阿莫西林克拉維酸鉀25 mg/kg，口服。

5 預后

患犬回家后狀態良好，精神狀況良好，吃喝正常，因此主人于2019年12月10日將潑尼松停藥。2020年4月23日，又出現尿血情況，血涂片可見大量球形紅細胞，判定IMHA復發，繼續使用潑尼松和阿莫西林克拉維酸鉀進行治療。2020年6月20日病情突然嚴重，主人選擇安樂死。

6 討論

6.1 發病機制

IMHA的發病機理主要是由于紅細胞在循環過程中被抗體包被，抗體包被的紅細胞跟補體結合在血管內發生溶解，或者被肝臟和脾臟內的巨噬細胞清除。抗體可能是針對紅細胞本身（自體免疫性溶血性貧血）的，也可能是針對外源性抗原的[2]。從免疫學角度看，B淋巴細胞與T淋巴細胞在自身免疫性溶血性貧血的發病機制中均有重要作用。B淋巴細胞通過接受或不接受特異性抗原刺激產生抗體，攻擊自身紅細胞。B1-α細胞和B2細胞數量上升，介導了IMHA患者亢進的自身體液免疫反應。而具有免疫抑制功能的Breg細胞數量減少，使機體免疫調節功能下降。T淋巴細胞中，Th細胞亞群及其分泌細胞因子的失衡參與了IMHA的發病，Th數量上升促進了效應B細胞的分化，Treg細胞數量減少，功能下降導致免疫功能降低。這些都是IMHA發病過程中的重要環節[3]。

原發性IMHA是由于抗體與未改變的紅細胞抗原結合，使自身抗原被識別并被免疫系統破壞導致，這些抗原在犬貓仍未研究清楚。包括免疫功能混亂，血細胞膜成分異常，自身免疫性疾病（如紅斑狼瘡），以及特定品種的遺傳因素（研究表明英國牧羊犬、史賓格犬、可卡犬、貴賓犬、柯利犬、雪納瑞犬等易發[4-6]）。繼發性IMHA是由于抗體結合外來抗原并粘附于紅細胞膜上，或抗體與抗原發生改變的紅細胞結合所致，包括感染、腫瘤、病毒、藥物（如頭孢菌素、青霉素）、疫苗、有毒物質（如鋅、洋蔥）、寄生蟲（巴貝斯蟲）等引起。免疫介導的溶血性貧血是人類臨床公認的副腫瘤綜合癥，慢性淋巴細胞性白血病是人醫公認的IMHA病因，盡管目前在動物臨床上仍缺乏直接證據，但不能排除腫瘤作為IMHA的潛在誘因[1]。藥物和毒素繼發的IMHA在臨床上也可見到，有實驗表明，14只接受遞增劑量頭孢他酮劑量的犬中有6只獲得了抗紅細胞抗體[9]，且有相當數量的文獻表明藥物和毒素可能繼發IMHA，因此在診斷時也應考慮到此類病因，并及時消除[1]。接種疫苗被認為是引發犬的IMHA的原因，在一項58只IMHA犬的研究中，15只犬（26 %）在發展為IMHA的1個月內（平均13 d，范圍1~27 d）進行了疫苗接種[7]，免疫過和未免疫過的患犬死亡率無明顯差異，但目前的疫苗接種策略是安全的，建議接種疫苗前應進行個體評估，以評估疫苗對自身的風險和益處[8]。該病例發病前一個月注射過疫苗，因此高度懷疑是由于疫苗接種導致的IMHA。

6.2 臨床癥狀

患IMHA的動物一般表現為精神沉郁、食欲減退甚至廢絕、四肢無力、趴臥不動、可視黏膜蒼白、高燒、呼吸促迫、心率加快、尿液呈棕紅色，嚴重者出現黃疸。嚴重貧血患犬甚至因供血不足和不良免疫反應出現四肢、尾、耳端等遠心端發冷壞死，顏色發紺甚至變黑[8]。

6.3 診斷

IMHA診斷取決于全血細胞計數（CBC）、血液涂片、血清生化檢測等，進一步診斷檢測需要判斷是否存在潛在的繼發病因。

6.3.1 全血細胞計數（CBC） 根據病史調查、臨床癥狀、血液檢查等初步懷疑IMHA的病例，首先要判斷該犬是否存在貧血，貧血時紅細胞系檢查可見各項指標均低于正常范圍，根據紅細胞壓積（PCV）可判斷貧血的嚴重程度，通常為中度至重度貧血。IMHA多為再生性貧血，但缺乏再生能力（即網織紅細胞數量不增多）并不能排除IMHA的可能，因為大約有30 % 的IMHA犬為非再生性貧血[1]，這是由于當IMHA急性發作和出現時，骨髓還未來得及作出反應及出現對抗骨髓前體的抗體；網織紅細胞在進入外周循環之前已經被破壞；炎癥抑制骨髓，紅細胞再生不良。多數IMHA患犬會存在炎性白細胞象。血小板的降低多是由于免疫介導性血小板減少癥、血栓和DIC等一種或多種原因引起[10-11]。通常可以通過網織紅細胞數超過100 000/μl或網織紅細胞指數（reticulocyte index，RI）的百分比超過3 %，且貧血表現為輕微到中度，初步判定為再生性貧血。但對于非再生性IMHA，則需要進一步通過骨髓穿刺對細胞學或組織學分析確診[12]。

本病例中，紅細胞平均血紅蛋白量MCH、紅細胞平均血紅蛋白濃度MCHC、網織紅細胞血紅蛋白RETIC-HGB都可以反應血紅蛋白濃度。由于發生溶血性貧血，大量紅細胞破裂溶血，血液中血紅蛋白隨尿液排出，同時骨髓未失去再生能力，代償性產生大量新生的紅細胞，發育成網織紅細胞進入血液。由于短時間大量產生新生紅細胞，機體可利用鐵大量流失，導致體內鐵儲存量降低，因此網織紅細胞血紅蛋白量降低，平均血紅蛋白量、濃度也隨之降低。而由于再生性貧血使骨髓紅細胞生成增加，最終使紅細胞數量等指標達到正常值，因此盡管RBC、HCT、HGB正常，但仍屬于貧血。紅細胞在溶解過程中產生大量分解物，激發了白細胞生成增加；另外，由于貧血導致組織器官缺氧性壞死，導致出現局部炎癥，因此CBC顯示WBC高于正常值，所以應使用抗生素進行治療。由于抗體包圍的紅細胞更易粘合在一起形成凝塊，甚至最終形成血栓，在此過程中有血小板參與，導致血液中PLT值應減少，但在本病例中，由于溶血性貧血繼發了骨髓的病理性增生，導致PLT增加。因此，PLT的數值可以作為IMHA治療效果評價的指標之一，若PLT數值增加，說明體內溶血性貧血仍在繼續，需要加大藥物劑量或更換免疫抑制藥物。

6.3.2 血液涂片檢查 血涂片可見紅細胞凝集像、網織紅細胞增多、大量球形紅細胞、紅細胞大小不等等變化。免疫介導性溶血性貧血的紅細胞形態學特點是出現大量的球形紅細胞。球形紅細胞是巨噬細胞移除部分抗體覆蓋的紅細胞膜而形成的，具有體積較小、圓形、深染，無中央灰白區域的特點，球形紅細胞較正常的紅細胞更脆且不易變形，通過脾臟時被清除。球形紅細胞在犬易被識別，但在貓識別困難，因為其正常紅細胞缺乏顯著的中心蒼白區。在犬出現足夠數量時可診斷為IMHA。影細胞為紅細胞胞質內幾乎不含血紅蛋白為特征，通常表面發生了血管內溶血，溶血可能由免疫性或非免疫介導性機制所誘發，因此，影細胞在IMHA時可能會出現，但對于IMHA不具有標志性的診斷意義。血涂片上可見紅細胞發生自體凝集。紅細胞凝集還可通過庫姆斯實驗（Coomb’s test）（直接抗球蛋白實驗）來確診，當自體凝集或球形紅細胞增多癥不出現時，使用多價抗血清的直接庫姆斯試驗最常用于診斷IMHA，不過，該檢測對于IMHA確診既不敏感也不特異。

在免疫介導性球形紅細胞形成過程中，針對紅細胞膜抗原、紅細胞膜與外源性抗原復合體或紅細胞膜新的抗原位點形成抗體，這些抗體與紅細胞相結合，為巨噬細胞識別并被其吞噬破壞。巨噬細胞，特別是脾臟巨噬細胞，部分吞噬紅細胞引起細胞膜相對細胞容積減少。余下的細胞膜重塑，產生較小的、濃縮的球形紅細胞。因機體產生抗紅細胞抗體，紅細胞表面本身的抗原或紅細胞與外來抗體結合，在有或無補體的情況下與抗體發生反應，引起紅細胞凝集或溶血。在本病例中血涂片中未發現巴貝斯蟲，PCR檢查也未發現巴貝斯蟲感染。因此可以排除寄生蟲繼發的IMHA。

6.3.3 血清生化檢測 紅細胞數量的降低可能導致全身不同程度的供血和供氧的不足，肝細胞可能會出現一定程度的損傷，導致肝臟酶指標的升高。由于紅細胞的溶解，常見高膽紅素血癥，但并非所有的IMHA均會出現，這取決于溶血的速率和肝臟的功能。IMHA犬的死亡與并發的肝臟衰竭和腎臟衰竭有關[13-14]，因此，肝腎功能指標的檢測對IMHA病例的預后有一定的提示意義。

本病例中生化檢查見天門冬酸轉氨酶和總膽紅素升高，總膽紅素升高是由于溶血，天冬氨酸轉氨酶的升高則提示肝組織損傷，由于膽紅素產生速度超過肝臟代謝能力，使肝臟超負荷，致使肝組織損傷。另外，由于貧血導致全身不同程度的供血和供氧不足，當肝臟無法獲得足夠的供血和供養的情況下，干細胞就會出現一定程度的損傷，導致肝酶升高。

6.3.4 尿檢 患IMHA的犬通常可見血紅蛋白尿，如果沒有引起肌紅蛋白尿的原因，尿液呈棕紅色，離心后上清紅色，或者在顯微鏡沉渣檢查沒有完整紅細胞的情況下，則認為存在血紅蛋白尿[1]。

本病例中出現血紅蛋白尿，尿液中尿膽原、膽紅素均高，是由于溶血時釋放出大量血紅蛋白，血紅蛋白被網狀內皮細胞轉變為膽紅素，游離于血漿中。游離膽紅素進入肝臟后，經肝細胞的攝取、結合、排泄，隨膽汁經總膽管排入腸道，最后被還原為尿膽原排出。當膽紅素產生速度超過肝臟轉化及機體排泄能力，膽紅素被血液帶到各個器官，出現黃疸。當損傷紅細胞釋放出的血紅蛋白量超出了結合珠蛋白的結合能力，游離血紅蛋白可經腎小球濾出，溢出過多不被腎小管完全吸收，而產生蛋白尿，稱為溶血性蛋白尿。綜合尿蛋白高、微量溶血、尿中白細胞高來看，很可能由于自身免疫性溶血產生的免疫復合物沉積在腎臟繼發了急性腎炎，導致腎小管功能減退，腎小球濾過作用下降，尿中出現潛血、白細胞、蛋白等，提示應及時應用抗生素進行治療。由于犬近一周食欲不振，長期處于饑餓狀態，因此尿酮體高，但因尿中有微量葡萄糖，也應考慮糖尿病的可能性。

6.3.5 其他進一步檢測 消除引起IMHA的病因可以減輕或阻止免疫介導的紅細胞破壞，并且可以避免長期免疫抑制治療的不良后果。感染、腫瘤、藥物、疫苗和炎癥可能是繼發IMHA的根本原因，需要通過完整的病史調查，尿液分析培養、影像學檢查、傳染性疾病檢測、骨髓細胞學或組織病理學、神經學檢查等一系列完整的體格檢查來逐一排除。據文獻報道，約有一半的IMHA患犬死亡是與血栓有關[15]，臨床關于犬D-二聚體檢查、凝血功能檢查也是至關重要的。

6.4 治療

6.4.1 輸血治療 是否輸血應取決于具體患者的具體情況，包括臨床癥狀的嚴重程度、靜息時血液中的乳酸濃度、品種正常的PCV/血細胞比容（Hct）值、貧血的發展速度以及患者監測和支持治療的有效性。應給急需紅細胞（即不輸血會導致動物死亡）的患者立即輸血，對于不能住院進行強化監護的進行性貧血患者，應盡早地考慮輸血。當患病動物表現出運氧量減少的臨床特征時，建議使用新鮮的濃縮紅細胞（pRBC）。如果沒有pRBC，則可以輸全血，不建議對IMHA的犬使用新鮮的冷凍血漿[16]。需考慮到自體凝集對交叉配血和血型檢測結果的影響。本病例因為發現較及時，并不需要進行輸血治療。

6.4.2 免疫抑制治療 免疫抑制藥物是預防IMHA患犬溶血的關鍵所在。在確診IMHA后，使用某些藥物，特別是糖皮質激素可能會干擾潛在疾病的檢測，如淋巴瘤，因此，應盡早對疑似癌癥或傳染病的病例進行診斷評估，診斷明確后應盡早開始使用高劑量糖皮質激素，能口服給藥的患犬，可選用潑尼松。使用潑尼松龍或潑尼松以初始劑量為2~3 mg/kg·d口服給藥，對于大于25 kg的犬，以50~60 mg/m2的初始劑量口服給藥。該藥物可以單日劑量給藥或分成兩日劑量給藥。如果患者最初不耐受口服藥物治療，則可以先靜脈內注射地塞米松（0.2~0.4 mg/kg·d）。在犬對治療有反應，即PCV/HCT穩定或增加的情況下，如果潑尼松或潑尼松龍的起始劑量 >2 mg/kg·d，建議在治療的前1~2周內將其降低至≤2 mg/kg·d。長期使用此類藥物有多種嚴重的副作用，會出現煩躁不安、多尿、過度氣喘、和嗜睡等癥狀，伴有肌肉無力或萎縮[16]。當開始治療后2周內PCV/HCT保持穩定且> 30 %時，且大多數疾病活動性指標（包括血球增多，血清膽紅素濃度和網織紅細胞數）均得到改善，可以減少強的松或潑尼松龍25 % 給藥劑量。如果為了限制糖皮質激素相關不良反應而引入了第二種藥物，則不應改變該藥物的劑量，但是如果犬對治療表現出足夠的反應，則潑尼松或潑尼松龍的劑量可進一步減少（25 % ~ 50 %）。若繼續治療效果良好、情況穩定，可以每3周將潑尼松或潑尼松龍的劑量減少25 %。在大多數情況下，潑尼松或潑尼松龍的典型治療時間預計為3~6個月，整體免疫抑制治療的預期持續時間為4~8個月。停用潑尼松或潑尼松龍后，在接受另一種免疫抑制藥物的犬中應選擇以下停藥方式之一：繼續使用免疫抑制劑4~8周并突然停藥；以和潑尼松龍或強的松同樣的減藥方式逐漸減少免疫抑制劑的給藥量[16]。

一些IMHA犬對單用糖皮質激素無反應，或潑尼松不能降至足以解決其副作用的劑量。這些病例，可以從治療開始就引入第二種免疫抑制藥物，以減少所需的糖皮質激素劑量。特別是以下情況：犬表現出嚴重或立即威脅生命的疾病的臨床特征；犬依賴輸血治療，輸血7 d后仍需輸血；嚴重不良反應，特別是大型犬。重病例開始就引入兩種免疫抑制劑，因為多數犬只對其中一種反應差，應避免同時使用三種及以上免疫抑制劑。推薦使用的免疫抑制劑包括：硫唑嘌呤（2 mg/kg或50 mg/m2PO每24 h）；環孢菌素（5 mg/kg PO每12 h）；霉酚酸酯（8~12 mg/kg PO每12 h）。有證據表明聯合環磷酰胺治療并沒有單獨使用糖皮質激素治療更有效，且可能對長期預后不利，因此不推薦環磷酰胺[16]。

人靜脈免疫球蛋白對于其它治療無效的IMHA患犬或許有很好的作用。目標是用外來免疫球蛋白抑制MPS內的Fc受體，進而減少對抗體包被紅細胞的吞噬。早期給予人靜脈免疫球蛋白在治療急性嚴重性IMHA可能最有用，以控制其它免疫抑制藥物等待發揮作用期間的急性溶血。此法缺點在于價格昂貴以及購買困難。

本病例使用潑尼松2 mg/kg進行治療，由于動物主人醫從性較差，2019年12月就自行停藥，后期復發后再使用潑尼松治療效果不佳。因此，對于IHMA的治療，大部分病例需要長期使用潑尼松。再次復發后，可以使用環孢菌素等聯合治療。

6.4.3 抗血栓治療 由于有很多急性或亞急性IMHA犬伴發黃疸和自體凝集，所有IMHA犬都應預防血栓形成，嚴重血小板減少癥（血小板計數 <30 000 μl）的患者除外。建議在診斷時開始進行血栓預防，一直持續到患者緩解并且不再接受潑尼松或潑尼松龍為止。優先使用普通肝素（UFH），進行個體劑量調整。普通肝素（IV）：100 U/kg推注，然后900 U/kg/24 h或普通肝素（SC）：150~300 U/kg·6h[16]。本病例中患犬PLT高于正常值，有較大可能并發DIC和血栓等疾病，為預防此類并發癥，在治療初期就采用靜脈輸注普通肝素。

6.4.4 脾臟摘除 以上療法基本無效的嚴重IMHA病例，需要考慮脾切除術。脾切除后可斷絕B細胞和巨噬細胞的來源，并消除紅細胞破壞的場所，以減少抗體的形成和紅細胞的破壞[16]。有效率在60 % ~ 70 %，對繼發性IMHA效果較差。本病例再次復發后，曾建議進行批臟摘除，但是主人拒絕。

6.4.5 支持療法 補液、吸氧、抗菌消炎、調節血氣電解質失衡，對癥治療等。

靜脈大量補液可以緩解和預防脫水、平衡電解質，并防止溶血產物對肝臟腎臟的持續性破壞。患IMHA的動物常食欲減退甚至廢絕，因此應靜脈輸注營養物質以補充能量。紅細胞溶解會激發白細胞大量生成，應用抗生素（如頭孢曲松）可緩解全身炎癥反應紅細胞大量溶解破壞，產生大量膽紅素需要肝臟代謝排出，對肝臟的負擔極重，極易造成肝細胞大量損傷。因此應給予護肝藥（如科特狀、奧普樂等）保護肝臟、增強肝功能[2]。本病例初期進行了大量補液，同時輸注營養物質，應對炎癥血象、血小板高及生化指標不正常等，采用了抗生素、肝素、護肝藥等進行對癥治療。

6.5 預后

IMHA多預后不良，一般情況下，病犬需要長期（通常是終身）進行免疫抑制治療。該病的復發和加重與停藥和減藥有關，需長期使用免疫抑制劑防止復發。評估血清膽紅素和尿素濃度在預測IMHA犬的預后方面可能是最有用的方法。長期隨訪的回顧性研究表明，IMHA的復發率為11 % ~ 15 %[13-14]。對于復發的犬：如果復發是在逐漸減少免疫抑制劑的過程中發生的，應增加免疫抑制劑的劑量；如果復發表現為暴發性疾病，應重新開始初始（以前成功的）用藥方案；如果復發表現為輕度疾病，則應將免疫抑制藥的劑量增加至最近一次減量之前患者接受的最后劑量。癥狀再次緩解后，應從緩解到第一次減量的時間增加一倍，而在隨后的減量之間的時間間隔應加倍。如果盡管采取上述措施仍復發，可能需要終生免疫抑制治療，力求使用最低劑量的免疫抑制藥物來維持緩解[16]。長期使用藥物治療的犬，需要定期進行血液和生化的監測，因為藥物可能引起骨髓抑制或肝臟中毒現象。

7 小結

本病例患犬臨床表現精神沉郁、食欲不振、四肢無力、高燒、心率加快、呼吸促迫、運動不耐受、尿液呈棕紅色等癥狀，符合IMHA的典型癥狀。本病例血液學檢查可見網織紅細胞增多、大量球形紅細胞、有紅細胞凝集像，生化檢查見天門冬酸轉氨酶和總膽紅素升高。尿常規檢查尿膽原、膽紅素、酮體、蛋白等值均高。根據以上癥狀綜合診斷此犬患IMHA。

本病例中患犬停藥四個月后復發，且各方面血項仍不正常，判斷其為預后不良。若再次停藥，可能會再度復發并加重病情，因此盡管糖皮質激素長期使用對機體有諸多副作用，仍需要長期用潑尼松龍，控制病情并防止再次復發。

在一項研究試驗中，有26 % 的IMHA犬在發病前一個月注射過疫苗[7]，本次接診的患病犬也于接診前一個月接診疫苗，且期間無其他致病因素存在，因此強烈懷疑IMHA是疫苗繼發。

注射疫苗后一些個體出現不良反應，如注射部位局部紅腫、乏力、食欲不振和發燒等，部分個體可能出現過敏反應。正常情況下注射疫苗引起IMHA卻極為少見。發生機理可能是，疫苗中的抗原與機體改變的紅細胞抗原決定簇結合，產生抗自身紅細胞抗體，或疫苗中變應原激發機體產生特異性IgM或IgG，與吸附于紅細胞表面外來抗原成分或紅細胞自身抗原發生特異性結合，促使I型變態反應的發生，紅細胞受損裂解，或細胞毒作用殺傷紅細胞，導致溶血[17]。

疫苗引起的溶血性貧血病例在人類臨床和獸醫臨床上都少見，并不能因此懷疑疫苗的安全性，但可以在接種疫苗前進行個體評估，以降低一系列風險，預防此類不良反應的發生，并采取各種有效措施，減輕不良反應引起的后果。