利用二硫化鎢對單鏈DNA的特異性吸附實現(xiàn)microRNA的雙組份檢測

馮 程

(常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 常德 415000)

MicroRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們在動植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控，對人體生長、發(fā)育、生理和病理等過程具有重要作用。因此microRNA的特異性識別和定量檢測對于基礎(chǔ)性研究和臨床診斷都是極其有意義的。本實驗根據(jù)魯米諾及石墨烯量子點的ECL反應(yīng)機(jī)理，設(shè)計了以二硫化鎢納米片為感應(yīng)平臺的生物傳感器，實現(xiàn)了對microRNA的雙組份檢測。首先利用二硫化鎢納米片對堿基數(shù)約為22的DNA單鏈的特異性吸附作用將標(biāo)記了魯米諾與石墨烯量子點的單鏈DNA吸附在滴有二硫化鎢的電極表面，該兩種單鏈DNA便吸附在了電極表面。此時由于WS2對魯米諾和石墨烯量子點具有ECL增強(qiáng)作用，得到了一個較高的ECL信號。當(dāng)加入目標(biāo)物microRNA時，microRNA與單鏈DNA雜交形成雙鏈離開電極表面，WS2不能增強(qiáng)其發(fā)光，得到了一個較低的ECL信號[1-3]。根據(jù)以上原理得到的ECL信號變化與兩種目標(biāo)物的濃度成一定的線性關(guān)系從而達(dá)到了同時檢測兩種microRNA的目的。隨著對microRNA的深入研究以及microRNA在疾病診斷的生物學(xué)標(biāo)記和藥靶中作用的日益突出，該生物傳感器可能會給人類疾病的治療提供一個新的發(fā)展平臺[4-5]。

1 實 驗

1.1 儀器與試劑

MPI-A型毛細(xì)管電泳電化學(xué)發(fā)光檢測儀；CHI610A型電化學(xué)工作站；FA-2004A FA/JA系列電子天平；SB-80超聲清洗機(jī)；TGL-20M高速臺式冷凍離心機(jī)；移液槍；三電極體系：玻碳電極(GCE，Φ=4 mm)及其修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為對電極；JBZ-12H磁力攪拌器用于石墨烯量子點的制備過程的攪拌。

氧化石墨烯；濃硝酸(分析純AR)；濃硫酸(分析純AR)；二硫化鎢；過硫酸鉀(分析純AR)；魯米諾；磷酸緩沖溶液(PBS，0.1 mol/L，pH 7.4)。所用其它試劑均為分析純，實驗用水均為二次去離子水。

本實驗當(dāng)中用到的所有寡核苷酸序列均合成于大連寶生物公司，并保存在4 ℃待用。

1.2 microRNA生物傳感器的構(gòu)建

玻碳電極的預(yù)處理：玻碳電極(Φ=4 mm)經(jīng)0.3、0.05 μm的Al2O3糊拋光2 min后用蒸餾水沖洗干凈，再在二次去離子水中超聲洗滌3 min，清洗后的電極置于室溫下晾干備用。

電極的自組裝過程：用移液槍吸取15 μL WS2溶液滴于預(yù)處理后的玻碳電極表面，于烘箱中烘干成膜。在得到的修飾電極表面分別滴上10 μL DNA-LUMINOL 和5 μL DNA-GQDs，使其在36 ℃烘箱中孵育2 h后，將目標(biāo)物microRNA-141和microRNA-155各5 μL滴于該電極表面上，在36 ℃烘箱中孵育2 h。

1.3 測試方法與檢測原理

本實驗中循環(huán)伏安法(Cyclic Voltammetry or CV)檢測及ECL檢測均采用三電極體系：經(jīng)修飾的玻碳電極(Φ=4 mm)作為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)作為參比電極，鉑電極為對電極。采用MPI-E型電致化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)對修飾電極的電致化學(xué)發(fā)光行為進(jìn)行研究，在2 mL的0.1 mol/L PBS(pH=7.4)溶液中，掃描電位為-1.6～0.8 V，均以200 mV/s電位掃描速度施加循環(huán)伏安(CV)掃描模式，溫度均為室溫。

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感器制備過程ECL表征

a.miRNA-141/miRNA-155/DNA-LUMINOL/DNA-GQDs/WS2/裸電極；b.DNA-LUMINOL/DNA-GQDs/WS2/裸電極圖1 傳感器制備過程ECL表征Fig.1 ECL characterization of the proposed biosensor

2.2 傳感器制備過程CV表征

通過測定修飾電極在5 mmol/LK3[Fe(CN)6]溶液中CV強(qiáng)度變化來表征傳感器的制備過程，如圖2所示：a曲線是裸電極的CV表征曲線，當(dāng)WS2孵育在電極表面時CV信號有所降低(曲線b)，原因可能是由于WS2阻礙了電子傳遞。當(dāng)DNA-LUMINOL和DNA-GQDs孵育在電極表面時，由于DNA大分子會阻礙電子傳遞，因此電流值減小得到了c曲線。當(dāng)目標(biāo)物miRNA-141和miRNA-155孵育在電極表面時，由于RNA鏈阻礙了電子傳輸，使CV信號再次降低，得d曲線。

a.裸電極，b.WS2/裸電極，c.DNA-LUMINOL/DNA-GQDs/WS2/裸電極，d.miRNA-141/miRNA-155/DNA-LUMINOL/DNA-GQDs/WS2/裸電極圖2 傳感器制備過程CV表征Fig.2 CV characterization of biosensor preparation process

2.3 ECL生物傳感器的性能

2.3.1 ECL生物傳感器的ECL信號響應(yīng)特性

本實驗研究了在最優(yōu)條件下，ECL生物傳感器孵育了濃度為1×10-15、5×10-15、1×10-14、1×10-13、5×10-12、5×10-11mol/L的microRNA-141標(biāo)準(zhǔn)溶液，其ECL信號如圖8所示，電位在-1.6 V處的峰為141/GQDs的峰。實驗結(jié)果表明，對于microRNA-141來說，其檢測范圍在1×10-15-5×10-11mol/L時線性回歸方程為：y=2166.81 lgc+8400.14(c為microRNA-141的濃度)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9953，檢出限為1.7×10-16mol/L(S/N=3)。

在最優(yōu)條件下，該ECL生物傳感器孵育了濃度分別為5×10-16、5×10-15、1×10-14、1×10-13、5×10-12、5×10-11mol/L的microRNA-155標(biāo)準(zhǔn)溶液，其ECL信號如圖3所示，電位在0.8 V處的峰為155/luminol的峰。實驗結(jié)果表明，對于microRNA-155來說，其檢測范圍在5×10-16-5×10-11mol/L時線性回歸方程為：y=2203.01 lgc+8676.00(c為microRNA-155的濃度)，相關(guān)系數(shù)R2=0.9963，檢出限為3.3×10-16mol/L(S/N=3)。

圖3 線性ECL圖Fig.3 Sensitivity of the proposed biosensor

2.3.2 實際樣品的檢測

為了進(jìn)一步證明microRNA在實際樣品中的應(yīng)用性，我們將從不同癌細(xì)胞中提取出的microRNA應(yīng)用于本傳感器中進(jìn)行雙組份檢測。我們選用了Hela細(xì)胞(子宮頸癌細(xì)胞)與22RV1(人類前列腺癌細(xì)胞)兩種細(xì)胞作為實際樣品檢測。結(jié)果如圖4所示，我們可以看出當(dāng)該生物傳感器孵育了Hela裂解液之后，由于microRNA-141在Hela中的低表達(dá)，相對于空白樣品來說，得到了較高的ECL響應(yīng)；而microRNA-155在Hela細(xì)胞中的高表達(dá)，帶走了電極表面的DNA-luminol，因此得到了較低的ECL響應(yīng)。同理，由于microRNA-141在22RV1細(xì)胞中的高表達(dá)，我們得到了較低的ECL響應(yīng)，而microRNA-155在22RV1細(xì)胞中相對較低的表達(dá)，得到了一個相對較高的ECL響應(yīng)值。由此證明我們設(shè)計的生物傳感器可以應(yīng)用于實際樣品的檢測。

圖4 在癌細(xì)胞裂解液中雙組份檢測miRNAFig.4 Multiplexed detection of miRNAs from different cancer cell Lysates

3 結(jié) 論

以ECL為基本檢測手段，我們進(jìn)行了microRNA雙組份檢測。本實驗以二硫化鎢納米片為感應(yīng)平臺，利用二硫化鎢納米片對單鏈DNA的特異性吸附作用將其吸附在滴有二硫化鎢的電極表面，其中單鏈DNA 1修飾有魯米諾，單鏈DNA 2修飾有石墨烯量子點。由于WS2對魯米諾和石墨烯量子點分別具有ECL增強(qiáng)效果，能得到一個較高的ECL信號。而當(dāng)加入目標(biāo)物時，microRNA-141和microRNA-155分別與單鏈DNA-LUMINOL和DNA-GQDs雜交形成雙鏈離開電極表面，WS2不能增強(qiáng)其發(fā)光，得到一個較低的ECL信號，且隨著目標(biāo)物的濃度變化，ECL信號與其呈現(xiàn)線性關(guān)系。該生物傳感器的響應(yīng)原理和制備方法簡單，并首次使用魯米諾和石墨烯量子點實現(xiàn)了microRNA的雙組份檢測，具有良好的選擇性和實際應(yīng)用性。