鹽度對SBR短程硝化系統中硝化細菌的影響*

余志英，龔澤平，王小蘭

(廣州大學生命科學學院，廣東 廣州 510006)

由于目前國內外對于高鹽滲濾液的研究極少涉及鹽度對SBR短程硝化過程中硝化細菌的影響，因此，逐步增加鹽度至25 g/L，探究SBR反應器中AOB與NOB在數量與種群多樣性的變化，可以為處理高鹽滲濾液的短程硝化工藝提供污水可處理鹽度參考范圍。

1 實 驗

1.1 材 料

實驗材料取自胡雪柳[11]的SBR短程硝化系統處理模擬垃圾滲濾液過程中的活性污泥。模擬垃圾滲濾液水質情況如表1所示。從初始鹽度為5 g/L的垃圾滲濾液中取出的活性污泥作為樣品1，逐步提高鹽度至25 g/L的垃圾滲濾液中取出的活性污泥作為樣品2，均在提高鹽度后運行周期的中后期取樣。各周期出水的三氮濃度、亞硝化率和氨氮去除率情況如圖1所示。

表1 模擬垃圾滲濾液水質Table 1 Water quality of simulated landfill leachate

圖1 不同鹽度下的出水水質Fig.1 Effluent quality under different salinities

1.2 實驗方法

1.2.1 熒光定量PCR法

絕對實時熒光定量PCR法一般是利用一系列已知濃度的標準品制作標準曲線，然后將在相同的條件下目的基因測得的熒光信號量同標準曲線進行比較，從而得到目的基因的量[12]。本實驗將標準品稀釋為10-5～10-9五個濃度梯度，然后進行定量PCR，以標準品拷貝數的對數值為橫坐標，以測得的CT值為縱坐標，繪制標準曲線[13]。制作標準曲線時質粒拷貝數公式：

C=6.02×1023×C0/M

(1)

式中：C為拷貝數(copies/μL)；C0為質粒濃度(g/mL)；M為含目的基因質粒的分子量(g/mL)。

采用PowerBiofilmTMDNA Isolation Kit試劑盒分別提取2個活性污泥樣品總DNA，經梯度PCR，重組DNA的構建，轉化大腸桿菌感受態細胞，篩選鑒定和熒光定量PCR，最后測出2種樣品中AOB和NOB的CT值即可計算出拷貝數。

1.2.2 DNA提取與測序

采集樣品1和2的活性污泥，使用PowerBiofilmTMDNA Isolation Kit試劑盒提取總的DNA，外加相應引物進行PCR擴增。

AOB-F:5'-GGAGGAAAGTAGGGGATCG-3'

AOB-R:5'-CGTCCTCTCAGACCARCTACTG-3'

NOB-F:TTTTTTGAGATTTGCTAG

NOB-R:CTAAAACTCAAAGGAATTGA。

然后用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進行DNA純化，得到目標AOB和NOB的DNA條帶，回收，通過T載體連接、感受態細胞轉化，得到AOB與NOB文庫。從文庫中選取培養成功的菌外加接種到SOC Amp培養基上的菌落送至生工生物公司進行測序。

2 結果與討論

2.1 鹽度(25g/L)對AOB與NOB數量的影響

圖2中以紅點繪制的AOB標準曲線的方程式為Y=-3.672X+48.705，線性范圍為105～109，擴增效率為87.211%，確定系數R2=0.992。

圖2 AOB熒光定量PCR標準曲線結果Fig.2 AOB Real-time PCR results

圖3中，以紅點繪制的NOB標準曲線方程式為Y=-3.876X+48.15，線性范圍為105～109，擴增效率為79.881%，確定系數R2=0.982。

圖3 NOB熒光定量PCR標準曲線結果Fig.3 NOB Real-time PCR results

處理樣品數據，由標準曲線方程計算出拷貝數，整理得表2和圖4。發現將垃圾滲濾液中的氯化鈉含量由5 g/L經70個周期逐步增加至25 g/L，AOB平均拷貝數下降了57%，而NOB平均拷貝數卻提高了3倍。由于拷貝數和菌的數量有直接的關系，所以拷貝數的下降意味著菌種數量的減少。結合張宇坤[9]的研究結果，當鹽度突然增加到25 g/L時，AOB的活性降低了68%。可見，在25 g/L的鹽度沖擊下，AOB的數量與活性都下降了一半以上。

表2 AOB與NOB定量PCR拷貝數Table 2 AOB and NOB Quantitative PCR copy number

圖4 AOB與NOB定量PCR結果柱狀圖Fig.4 AOB and NOB quantitative PCR results histogram

為進一步驗證逐步增加鹽度對硝化細菌數量的影響，是否能說明SBR反應器中的短程硝化轉變為全程硝化，將兩個樣品的拷貝數進行整理得到圖5。多數研究報告指出，全程硝化工藝中AOB與NOB的數量比(A/N)要高于1:2，而要實現短程硝化的穩定進行，其中的A/N就必須接近于1:0[14,17]。結合圖5分析可知，低鹽環境下的短程硝化過程，AOB從數量上看為優勢菌，且NOB數量很少，符合短程硝化NO2--N積累的特點。但AOB與NOB的數量比為87:13，在數量級上A/N并不是很接近1:0。而25 g/L鹽度下，AOB數量的下降與NOB數量的上升，使得A/N比變為40.7:59.3，約等于0.69，高于1:2。如此一來，說明在SBR反應器中，硝化細菌的變化可以間接的判斷反應器中硝化過程的類型。高鹽環境下，短程硝化系統會被破壞，轉變為全程硝化。

圖5 氯化鈉(25 g/L)抑制前與抑制后AOB與NOB在硝化細菌中的占比Fig.5 The proportion of AOB and NOB in nitrifying bacteria before and after inhibition of sodium chloride(25 g/L)

2.2 鹽度(25 g/L)對AOB群落結構的影響

圖6 樣品1測序結果用Neighbour-joint 法構建的系統發育樹Fig.6 Sample 1 sequencing results phylogenetic tree constructed with Neighbour-joint

本實驗中樣品1送樣31個，樣品2送樣31個。測序結果在數據庫GenBank 采用BLAST 程序進行同源性檢索，把同源性較高的認為是同一種屬，如若出現多個相似度高的不同種屬，則選其中一種為代表。其中樣品1 BLAST結果為14個不同可培養的OTU，樣品2結果為15個不同的OUT。在 NCBI 上搜索參考序列，利用軟件 MEGA-X 對樣品1與樣品2的序列進行遺傳關系分析，采用Neighbour-joint 法構建系統發育樹，如圖6，圖7所示。

圖7 樣品2 測序結果用Neighbour-joint 法構建的系統發育樹Fig.7 Sample 2 Sequencing results Phylogenetic tree constructed with Neighbour-joint(注：括號里的數字表示為所含序列數，以98%的序列相似性劃分菌種，每個菌種隨機挑選一條代表序列用于構建AOB序列系統發育樹。)(Note:The numbers in parentheses indicate the number of sequences contained,and the strains are divided by 98% sequence similarity.Each strain is randomly selected to represent the phylogenetic tree of AOB sequence.)

根據圖6、圖7的結果發現，所測樣品全部屬于變性菌綱(Proteobacteria)的β-亞綱下的亞硝化單胞菌群(Nitrosomonas)。樣品1中的8個菌種在樣品2中未檢測到，推測其為不耐鹽菌，因高鹽度形成的高滲透壓環境，以及高氯離子對微生物產生的毒害作用，微生物的代謝功能與活性受到強烈的抑制，所以在25 g/L的鹽度沖擊下大量死亡[8]。樣品2中新增了8類菌種，但序列數均不超過2，占全部AOB序列的66.7%。這與鄒高龍[5]的觀點一致，即由于微生物強大的環境適應能力，部分AOB為適應高鹽環境，會改變其代謝途徑，最終引起菌種的改變。然而，由于AOB平均代時長，缺少由不耐鹽菌轉變為耐鹽菌的緩沖期，使得耐鹽菌未能在短時間內成為優勢菌，超過半數的不耐鹽菌因失水死亡，氨氧化過程受到一定的影響。

2.3 鹽度(25 g/L)對NOB群落結構的影響

將測序結果進行整理得到NOB的11類不同序列，位點差異情況如表3所示。

表3 堿基差異位點表Table 3 Base difference locus table

表2表明，送去測序的菌中有62.5%的序列相同，其中差異點主要為35號位點A的嵌入或丟失，少數有差異位點的菌與大多數序列一致的菌差異位點不超過三個，同一個位置的差異位點在其他序列中差異數不超過兩個。由此可認為序列中NOB種類可能不是很多，即原來菌群的種類不多。

將序列上傳到NCBI的BLAST進行比對并整理，以考察序列的物種名稱。由于相似度很高且匹配度與匹配值相同，所以3、4、5 可能有以下兩個種類：Nitrobacter sp.strain Nato、Nitrobacter winogradskyi(ATCC 25381)。同理1、2、6、7、8、9、10、11可能有以下四個種類：Nitrobacter sp.NKU、Nitrobacter sp.NBW1、Nitrobacter winogradskyi strain Nb-255和Nitrobacter sp.Strain 311。

圖8 Clustalw進化樹Fig.8 Clustalw phylogenetic tree

將序列上傳到Clustal W進行分析，以分析序列間起源關系，得出圖8。根據親緣關系及相似性，我們將3和5歸為Group I；將6、7、8歸為Group II；4單獨歸為Group III；2、11、10歸為Group IV；9、1歸為Group V。因此，認為加鹽抑制后SBR反應器中一共有5種類型的NOB。高鹽環境下，NOB數量、種群多樣性增加，一定存在Nitrobacter winogradskyi(ATCC 25381)和Nitrobacter sp.strain Nato兩種菌，而Nitrobacter sp.NKU、Nitrobacter sp.NBW1、Nitrobacter winogradskyi strain Nb-255和Nitrobacter sp.Strain 311四種菌中一定存在三種。

3 結 論

(1)通過測定樣品中AOB與NOB特定基因序列含量，比較低鹽度5 g/L與高鹽度25 g/L環境下各自拷貝數的差異，發現鹽度增加后AOB數量下降了57%，而NOB數量卻提高了3倍，硝酸化過程被激活，短程硝化系統被破。

(2)SBR短程硝化系統中優勢菌為AOB，逐步增加鹽度至25 g/L后則轉變為NOB。鹽度的增加使得SBR反應器中的短程硝化轉變為全程硝化，即可通過硝化細菌數量的變化規律簡單判斷硝化過程的類型。

(3)NOB與AOB相比，在逐步增加鹽度馴化過程中更容易適應高滲環境，出現耐鹽菌種。