廣藿香多酚類成分的提取工藝及其黃嘌呤酶抑制活性研究*

洪 玲，張遠芳，許明媚，劉 芳

(湘南學院，湖南 郴州 423000)

廣藿香(Pogostemoncablin(Blanco)Benth.)為唇形科雌蕊草屬植物的地上干燥部分，廣東的道地藥材，“十大廣藥”之一，主產于廣東、海南等地，植物資源豐富，是一種非常重要的傳統中藥。廣藿香的活性成分是哪些呢？一直以來，廣藿香研究的焦點主要集中在揮發油部分，隨著研究的深入，發現廣藿香非揮發油部分也具有較好的生物活性。課題組前期研究發現廣藿香多酚類成分在某些方面較揮發油部分具有更好的生物活性，同時，文獻調研也顯示廣藿香大極性成分具有較好生物活性，如Su-Young Park等[1]的研究表明廣藿香水提物對TNBS誘導的UC有改善作用；廣藿香水提物可以抑制因鋅(Zn)不正常引起腸道絨毛損害[2]；任恒鑫等發現廣藿香黃酮類化合物有可能是其治療腸易激綜合癥的藥效成分[3]；Kim EK等[4]發現廣藿香黃酮類成分具有良好抗氧化和肝細胞保護作用。另外，2015版《中國藥典》收錄含廣藿香的50余種成方制劑中，24種以藥材磨粉制丸的形式入藥，19種以藥材水提液加水蒸汽蒸餾液的形式入藥(即以水提物和揮發油成分共同入藥)，1種(鼻炎康片)直接以藥材水提液入藥，僅有4種是直接以廣藿香油入藥，2種以乙醇浸出物入藥，提示廣藿香的藥效成分不僅是揮發油成分，揮發油以外的成分也具有重要的地位。

廣藿香藥材中具有大量多酚類成分[5]，植物多酚類成分具有多種藥理活性[6-8]如抗氧化、抗癌、抗病毒、抗心腦血管疾病、調血脂、抗炎等，但對廣藿香多酚提取工藝、抗氧化作用及黃嘌呤氧化酶抑制活性等研究還未見報道。本文以多酚類成分得率為考察指標系統優化了從廣藿香藥材中提取多酚類成分，并對提取得到的多酚類成分進行了抗氧化作用和黃嘌呤氧化酶抑制作用進行了研究。為廣藿香藥材的進一步開發利用提供理論依據。

1 實 驗

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料和試劑

本研究對象為廣藿香，為河北金葉子藥業有限公司所生產，產地為廣東，批號190202C043。實驗所用水為超純水；DPPH標準品，優級純，福州飛凈生物科技有限公司；福林酚試劑，生物試劑，國藥集團化學試劑有限公司；沒食子酸，純度99%，阿拉丁；無水乙醇，無水碳酸鈉，水楊酸，硫酸亞鐵，3%過氧化氫，均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；黃嘌呤氧化酶，貨號X1875-5UN，sigma；黃嘌呤，高級純，薩恩化學技術上海有限公司。

1.1.2 儀 器

UV-9000型紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司；HWA-26電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器有限公司；BSA223S電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；CS-10B高純水發生儀，力辰科技；PTHW HEATER電熱套，河南愛博特科技發展有限公司。

1.2 實驗內容

1.2.1 沒食子酸標準曲線的制作

精密稱取沒食子酸標準品11 mg于100 mL容量瓶，用水溶解并定容至刻度，得到濃度為0.11 mg/mL的標準液。分別準確吸取標準液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8、3.2以及3.6 mL置于50 mL的容量瓶中，以蒸餾水補至12.0 mL，加入福林酚試劑1.0 mL，充分混勻，在5 min內加入3.0 mL 20%的碳酸鈉溶液，混合后用再用蒸餾水定容，50 ℃避光水浴20 min，以蒸餾水為空白對照，在760 nm下測定吸光值，每個樣品平行測定3次。以沒食子酸在反應體系中的濃度C(mg/mL)為橫坐標，以對應的平均吸光度值A為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.2 廣藿香多酚的提取方法與多酚含量的測定

取廣藿香樣品，密封備用。對乙醇體積分數(20%，30%，40%，50%，60%，70%)料液比(g/mL)(1:10，1:20，1:30，1:40，1:50，1:60，1:70)、提取時間(20，40，60，80，100，120，140 min)以及提取溫度(30，40，50，60，70，80 ℃)這幾個因素進行單因素試驗。根據單因素試驗的結果，選擇乙醇體積分數、料液比、溫度和時間為廣藿香多酚的 4 個影響因素，每個因素設 3 個水平，采用 L9(34)正交表進行試驗。稱取廣藿香樣品5 g，放入圓底燒瓶瓶中，按上述單因素及正交試驗設定的條件加入提取劑，放入電熱套中，恒溫冷凝回流提取一定時間，取出冷卻，過濾，洗滌殘渣，濾液合并定容至提取劑原體積。吸取提取液適量按“2.2”的方法測定，計算多酚得率：

多酚得率(mg/g)=c×V×n/m

式中：c 為樣液多酚的質量濃度/(mg/mL)；V 為提取液體積/(mL)；n 為稀釋倍數；m 為樣品質量(g)。

1.2.3 廣藿香多酚對 DPPH·自由基清除能力的測定

按最佳條件提取廣藿香多酚，所得樣液用于進行抗氧化試驗。參照參考文獻[9]的方法稍作修改，將0.1 mg/mL DPPH·的無水乙醇溶液 1 mL和樣液 1 mL 混勻，室溫下避光反30 min，在 517 nm 處測定吸光度。清除率按下式計算：

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100%

式中：A1為樣液與DPPH·溶液的吸光度；A2 為樣液的吸光度；A3為 DPPH·溶液的吸光度。

1.2.4 廣藿香多酚對黃嘌呤氧化酶的抑制作用

實驗設有B1、B2、B3、B4四組，每組所加試劑不同，具體所加試劑操作如表1所示。在加入黃嘌呤氧化酶后均需于 37 ℃水浴10 min，水浴結束后立即加入1 mL鹽酸(1 mol/L)使反應終止，于290 nm處測定吸光度。

表1 抗黃嘌呤氧化酶實驗試劑操作Table 1 Operation of antixanthine oxidase reagents (mL)

每個樣品平行三次實驗，計算平均吸光度代入酶抑制率公式：

酶抑制率=(1-(B1-B3)/(B2-B4))×100%

2 結果與討論

2.1 沒食子酸標準曲線

圖1為沒食子酸標準曲線圖。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

沒食子酸線性關系的考察：以沒食子酸質量濃度c(mg/mL)為橫坐標，對應平均吸光度值A為縱坐標，計算得線性回歸方程為：y=89.5427x+0.0474，相關系數R2=0.99903在0.0018～0.008 mg/mL范圍內，沒食子酸質量濃度與其吸光度具有良好的線性關系。

2.2 廣藿香多酚提取的單因素試驗

2.2.1 料液比的影響

圖2為料液比對廣藿香多酚得率的影響圖。

圖2 料液比對廣藿香多酚得率的影響圖Fig.2 Effect of material liquid ratio on the extraction rate of polyphenols from Pogostemon cablin

由圖2可以看出，料液比(g/mL)從 1:10 到 1:50，廣藿香多酚的得率逐漸增加，說明增加溶劑用量有助于多酚類物質的溶出；但料液比繼續增大，多酚得率反而稍微降低，說明多酚類物質已基本提取完全，繼續增大溶劑反而會增大損耗。所以料液比確定為1:50。

2.2.2 乙醇體積分數的影響

圖3為乙醇體積分數對廣藿香多酚得率的影響圖。

圖3 乙醇體積分數對廣藿香多酚得率的影響圖Fig.3 Effect of the ratio of ethanol to water on the extraction rate of polyphenols from Pogostemon cablin

由圖3可以看出，乙醇體積分數較低時，廣藿香多酚的得率隨乙醇體積分數增加而增大；當乙醇體積分數達到40%時，廣藿香多酚的得率最高，隨著乙醇體積分數再增大，得率逐漸降低。多酚是多羥基酚類化合物的混合物，不同的物質其多酚物質的組成不同，因而極性不同，需要選擇與其極性相適應的溶劑使其溶出率最高。結果表明，乙醇體積分數為40%最適合提取廣藿香多酚。

2.2.3 提取時間的影響

圖4為提取時間對廣藿香多酚得率的影響圖。

圖4 提取時間對廣藿香多酚得率的影響圖Fig.4 Effect of extraction time on the extraction rate of polyphenols from Pogostemon cablin

由圖4可以看出，廣藿香多酚的得率隨時間的延長先升高降低，100 min時得率最高，可能是提取時間長會導致多酚類物質發生氧化等反應使其結構被破壞。后續試驗選擇提取時間為100 min。

2.2.4 提取溫度的影響

圖5為提取溫度對廣藿香多酚得率的影響圖。

圖5 提取溫度對廣藿香多酚得率的影響圖Fig.5 Effect of extraction temperature on the extraction rate of polyphenols from Pogostemon cablin

由圖5可以看出，隨著溫度的升高，廣藿香多酚的得率先增加后逐漸降低，可能是溫度越高，多酚物質越不穩定。在60 ℃時得率最高，所以選擇提取溫度為60 ℃。

2.3 正交試驗

根據單因素的結果，設計L9(34)正交表，以廣藿香多酚的提取率作為評價指標，進行正交試驗，正交設計如表2所示，結果如表3所示。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factor level table of orthogonal experiment

表3 正交試驗設計與結果Table 3 Orthogonal experimental design and results

根據單因素試驗的結果進行正交試驗，正交試驗設計與結果見表 3。極差分析結果表明，料液比對廣藿香多酚得率的影響較大，提取時間、乙醇體積分數和溫度對廣藿香多酚得率的影響依次減少，因素主次順序為：B>D>A>C。根據正交表，從廣藿香中提取多酚的最佳方案為：A3B3C3D2，即50%乙醇，料液比(g/mL)1:60，提取溫度50 ℃，提取時間120 min，按此優化后的提取條件進行三次平行驗證試驗，廣藿香多酚的得率為(10.652±0.06)mg/g。

2.4 廣藿香多酚對 DPPH·自由基清除能力的測定

圖6為廣藿香多酚對 DPPH·自由基清除能力的測定。

表5 廣藿香多酚對DPPH·自由基的清除能力Table 5 Scavenging ability of Pogostemon cablin polyphenols on DPPH radical

圖6 廣藿香多酚對 DPPH·自由基清除能力Fig.6 Scavenging ability of Pogostemon cablin polyphenols on DPPH radical

DPPH·自由基清除試驗是評價天然產物抗氧化活性的一種常用方法。由圖6可以看出，廣藿香多酚能清除DPPH·自由基，且在試驗質量濃度范圍內對DPPH·自由基的清除能力都隨質量濃度的升高逐漸增強，IC50=0.0064 mg/mL。

2.5 廣藿香多酚對黃嘌呤氧化酶的抑制作用

對含有不同濃度的廣藿香多酚提取物(mg/mL)進行黃嘌呤氧化酶抑制實驗，結果如圖7所示，IC50=0.0224 mg/mL。

表6 廣藿香多酚對黃嘌呤氧化酶的抑制作用Table 6 Inhibitory effect of Pogostemon cablin polyphenols on xanthine oxidase

圖7 廣藿香多酚對黃嘌呤氧化酶抑制作用Fig.7 Inhibitory effect of Pogostemon cablin polyphenols on xanthine oxidase

3 結 論

黃嘌呤氧化酶的活性對體內尿酸的產生有至關重要的作用，核酸分解代謝過程中的中間產物黃嘌呤和次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下可氧化生成尿酸，隨尿排出，因尿酸溶解度較小，體內過多時可形成尿路結石或痛風[10]。黃嘌呤氧化酶在氧化黃嘌呤時也產生過氧化物質。過氧化物是在代謝過程中產生的一類能損傷蛋白質、DNA、酶活性的物質，與炎癥、衰老、退行性病變及腫瘤等病理過程有關[11]。抗氧化物通過抑制過氧化物的產生及及時轉變過氧化物質而對機體發揮保護作用。抗氧化劑可通過測定還原力來表示抗氧化活性的強弱，抗氧化物質自身具有給出電子的能力，繼而清除自由基發揮抗氧化作用，還原力越強，抗氧化性越強。

在我們的前期研究中發現廣藿香水提物具有較好的黃嘌呤氧化酶抑制活性，經研究發現水提物中含有大量的酚酸類成分，推測廣藿香酚酸類成分具有較強的黃嘌呤氧化酶抑制作用。為驗證推測本文以多酚類成分得率為考察指標對廣藿香進行提取工藝優化，得到的最優提取工藝為：在50 ℃的溫度下，以50%乙醇為提取溶劑，料液比(g/mL)為1:60，提取時間為120 min時，廣藿香多酚的得率最高為(10.652±0.06)mg/g。對采用優化后的提取工藝獲得的廣藿香多酚提取物進行黃嘌呤氧化酶抑制作用研究時顯示廣藿香多酚具有較好的黃嘌呤氧化酶抑制活性，其IC50=0.0224 mg/mL，驗證了之前的推測，說明廣藿香多酚可以通過抑制黃嘌呤氧化酶的活性減少尿酸的形成而降低血中尿酸的含量，從而對痛風和痛風性關節炎產生有效的預防和治療作用。同時實驗顯示廣藿香多酚對DPPH·自由基具有較強的清除能力，最大清除率可達98.86%，可以減少炎癥的發生及減少組織的損傷。總之，本研究為廣藿香多酚預防和治療痛風和痛風性關鍵炎奠定了扎實的實驗基礎，為廣藿香藥材的開發利用提供了研究方向。