Cocktail探針藥物法研究化合物PT-46的CYP酶系抑制作用*

王麗麗，程 飛，張娜娜，鄭雪梅，張吉泉,，陳 瑞

(1 貴州醫科大學/貴州省化學合成藥物研發利用工程技術研究中心，貴州 貴陽 550025；2 貴州醫科大學藥學院，貴州 貴陽 550025)

癌癥(又稱惡性腫瘤)的發病率和死亡率逐年上升，已成為世界范圍內的主要公共衛生問題。據世界衛生組織最新發布的《2020全球癌癥報告》顯示，2018年全球新增癌癥并列1810萬例，死亡960萬例。其中，我國新增癌癥病例380.4萬例、死亡229.6萬例[1]。相比于其他國家，我國癌癥的發病率和死亡率位列全球首位。因而，抗腫瘤藥物的研發面臨巨大的臨床需求。

靶向磷脂酰肌醇-3 激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路成為近年來抗腫瘤創新藥物研究的熱點[2-3]。化合物PT-46是課題組前期研究得到的取代苯并咪唑抗腫瘤活性優選化合物(圖1)，是一個PI3K/mTOR雙靶點抑制劑[4]。該化合物在HCT116細胞上具有較高的抗增殖活性(IC50值為0.3 μM，為陽性對照PF-05212384的4.67倍)[4]，是一個值得進一步研究和開發的抗腫瘤優選化合物。

圖1 PT-46的化學結構Fig.1 The chemical structure of PT-46

藥物主要是在肝臟里面代謝，其中細胞色素CYP(P450)酶是其主要的代謝酶，主要包含的CYP3A4、2C19、2C9、2D6、1A2酶參與了體內大約80%以上的藥物代謝[5-7]。CYP酶是一個多功能的酶系，在體內具有可抑制性和可誘導性。藥物與藥物相互作用能夠在體內的所有過程(主要包括吸收、分布、代謝和排泄)中發生，其中在代謝過程中尤為明顯，約占40%[8-9]。所以藥物對于CYP酶的抑制作用研究是必不可少的，也是藥物在臨床前研究的重要一步，可為藥物臨床研究提供誘導效果與抑制效果的相關信息[10]。研究體外藥物代謝與藥物相互作用時最常采用肝微粒體法，該方法具有操作簡單、重復性好等的特點[11]。

鑒于PT-46新穎的化學結構及良好的抗增值活性，本次實驗采用肝微粒體法，運用Cocktail探針底物法研究PT-46對體外人肝微粒體中5種常見CYP酶的抑制作用，進而了解潛在的藥物相互作用，旨在為后期該化合物的臨床前研究或新藥研發提供參考依據。

1 材 料

1.1 儀 器

X1型高速離心機，香港基因有限公司；數顯恒溫水浴鍋，上海邦西儀器科技有限公司；FA805N型十萬分之一電子天平，上海菁海儀器有限公司；DW-86L486型超低溫保存箱，海爾集團公司；優普系列超純水機，四川優普超純科技有限公司；KH-600E型超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司；Xevo G2-XS型UPLC-四級桿串聯飛行時間質譜儀，美國Waters公司。

1.2 藥品與試劑

PT-46(純度：>98%，批號：20201026)，貴州醫科大學藥物化學重點實驗室制備；5-羥基奧美拉唑、羥基甲苯磺丁脲、6β-羥基睪酮等對照品(批號：1-PSB-27-2、1-PSB-27-2、KIT0635，純度≥98%)，加拿大TRC公司；葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-P-DH，批號：20160725)，北京索萊寶科技有限公司；磷酸鹽緩沖液(PBS，濃度0.01 mol/L，pH7.4，批號：409L024)，北京索萊寶科技有限公司；右美沙芬對照品(批號：01155029-75469A，純度≥98%)，上海泰坦科技股份有限公司，非那西丁對照品(批號：81105，純度>98%)，美國Sigma公司；奧美拉唑、甲苯磺丁脲、睪酮、對乙酰氨基酚、(+)-N-3-芐基香酚、奎尼丁、磺胺苯吡唑、酮康唑和α-萘黃酮等對照品(批號：100367-201305、100369-201307、L31J8T40939、SJ0711GA14、L27J9B64115、J09M6B1、A22M10L83645、100294-201203、B20083，純度≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；右啡烷對照品(批號：FK-J1795，純度>98%)，上海樊克生物科技有限公司；葡萄糖-6-磷酸-二鈉(G-6-P-Na2，批號：116B039)、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸膦酸二鈉(NADP-Na2,批號：718B0225)、葛根素對照品(內標，純度：>98%，批號：528C021)；乙腈、甲酸、甲醇均為色譜純，檸檬酸鈉、氯化鎂等其余試劑均為實驗室常用規格或分析純，水為蒸餾水。

2 方 法

2.1 PT-46和內標溶液的制備

精密稱取適量PT-46化合物，用甲醇溶解并定容，配制成質量濃度為5.0 mmol/L的貯備液，同法制得質量濃度為10 μmol/L內標溶液(含葛根素)，放置在4 ℃下保存，備用。使用前，將PT-46貯備液用甲醇稀釋，配制成質量濃度分別為5.0、1.5、0.5、0.15、0.05、0.015、0.005 mmol/L的溶液。

2.2 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)輔酶溶液的制備

依次稱取200 mg G-6-P-Na2、200 mg NADP-Na2和133 mg 氯化鎂，用水溶解，溶解后定容至10 mL，放置在-20 ℃下保存備用，記為A液。依次稱取44 mg 1 000 U G-6-P-DH和檸檬酸鈉，用水溶解，溶解后定容至25 mL，放置于-20 ℃下保存備用，記為B液。使用時，將AB兩液按體積比5:1分別加入至孵育體系中。

2.3 混合探針底物溶液的制備

參照文獻方法，精密稱取4.32 mg奧美拉唑、7.557 mg非那西丁、12.3 mg右美沙芬、7.21 mg睪酮、13.5 mg甲苯黃丁脲，用甲醇溶解各底物并定容至10 mL作為探針底物貯備液。使用前，精密吸取上述探針底物的貯備液1.0 mL于5.0 mL量瓶中，氮氣吹干，加入80 μL甲醇和20 μL DMSO溶解混合底物，最后再用0.1 mol/L PBS定容至5 mL。此時，混合探針底物溶液中奧美拉唑、非那西丁、甲苯黃丁脲、睪酮、右美沙芬的質量濃度分別為1000、1500、1000、500、250 μmol/L。

2.4 特異性抑制劑的制備

分別稱取適量α-萘黃銅(CYP1A2)、磺胺苯吡唑(CYP2C9)、(+)-N-3-芐基香酚(CYP2C19)、奎尼丁(CYP2D6)、酮康唑(CYP3A4)，用甲醇溶解稀釋制成質量濃度均為1 mg/mL的單一貯備液。臨用時，用甲醇分別配制為質量濃度為0.136、0.157、0.088、0.162、0.266 mg/mL備用。

2.5 肝微粒體體外孵育體系的建立

取人肝微粒體適量，用PBS稀釋至0.5 g/L，孵育終體系為200 μL(100 mmol/L PBS)。取20 μL人肝微粒體于反應體系中，分別加入110 μL PBS、20 μL PT-46或特異性抑制劑、30 μL NADPH輔酶溶液(A液25 μL，B液5 μL)，在冰浴中操作；迅速放入37 ℃水浴鍋中，孵育3 min，加入20 μL混合探針底物溶液開始反應，反應時間為60 min，平行3組。確保孵育體系中溶解探針藥物的DMSO含量不超過0.1%，甲醇含量不超過1%。反應結束后加入200 μL冰乙腈(含10 μmol/L)讓反應終止，渦旋儀渦旋60 s，在13000 r/min下離心10 min，取上清液，氮氣(N2)流吹干，殘留物用200 μL甲醇進行復溶，再13000 r/min下離心10 min，取適量上清液進行超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC-MS/MS)分析。

2.6 UPLC-MS/MS法檢測

2.6.1 色譜與質譜條件色譜條件

AC QUITY UPLC?BEH C18(2.1 mm× 100 mm，1.8 μm)；流動相：0.01%甲酸水-0.01%甲酸乙腈，梯度洗脫(見表1)；柱溫：40 ℃；流速：0.4 mL/min；進樣量：2 μL。質譜條件：電噴霧電離源(ESI)，正負離子靈敏度模式，數據采集范圍質荷比(m/z)100～1200，毛細管電壓為2.0 kV(正模式)、1.5 kV(負模式)，脫溶劑的溫度：400 ℃(正模式)、450 ℃(負模式)，離子源溫度：120 ℃(正模式)、110 ℃(負模式)，碰撞氣：氮氣，霧化氣：氬氣，錐孔氣流量：50 L/h，脫溶劑氣流量：800 L/h。采用亮氨酸腦啡肽(1 ng/mL)和甲酸鈉(0.5 mmol/L)分別進行質量軸的校正和質量數的實時校正。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Mobile phase gradient

表2 質譜條件Table 2 Mass spectrometer conditions

2.6.2 方法學考察

2.6.2.1 專屬性

取人肝微粒孵育液，除不加探針藥物和內標外，其余按“2.5”項操作，獲得空白樣品色譜圖A；將一定濃度的代謝物標準溶液和內標溶液加入滅活的人肝微粒體孵育液，同上操作得色譜圖B。

2.6.2.2 線性

分別取適量羥甲基苯磺丁脲、6β-羥基睪酮、5-羥基奧美拉唑、右啡烷、對乙酰氨基酚單一貯備液，用甲醇稀釋成羥基甲苯磺丁脲質量濃度分別為0.15、0.30、0.61、1.22、2.44、4.88 μmol/L，6β-羥基睪酮質量濃度分別為3.67、7.34、14.68、29.34、58.68、117.37 μmol/L，5-羥基奧美拉唑質量濃度分別為0.10、0.19、0.38、0.77、1.54、3.09 μmol/L，右啡烷質量濃度分別為0.36、1.44、4.32、8.64、17.28、34.56 μmol/L，對乙酰氨基酚質量濃度分別為0.26、0.52、1.04、2.09、4.18、8.35 μmol/L的系列溶液，按“2.5”項下方法處理后進樣進行測定，記錄各峰面積。以上述成分質量濃度(x，μmol/L)為橫坐標、與其內標峰面積之比(y)為縱坐標進行線性回歸分析，結果見表3。

表3 鼠肝微粒體孵育體系中5種代謝物的線性Table 3 Linearity of 5 metabolites in mouse liver microsome incubation system

注：1.對乙酰氨基酚；2.右啡烷；3.6β-羥基睪酮；4.5-羥基奧美拉唑；5.葛根素；6.羥基甲苯磺丁脲圖2 總離子流圖Fig 2 Total ion chromatograms

2.6.2.3 準確度、基質效應、精密度以及穩定性

分別配制含有對乙酰氨基酚等5種代謝物的孵育體系的低、中、高3個濃度質量控制(QC)樣品，每一濃度平行重復5個樣品，按“2.5”項下方法處理樣品后進樣分析，考察精密度和準確度；取空白肝微粒體的孵育體系200 μL，置于2 mL Ep管內，按“2.5”項下方法處理，氮氣流吹干后，各用質量濃度低、中、高的對乙酰氨基酚等5種代謝物對照品溶液200 μL復溶，每個濃度平行5份，計算各代謝物與內標峰面積比值(Ⅰ)與同樣濃度的5種代謝物對照品溶液直接進樣獲得的峰面積(Ⅱ)的比值，考察基質效應。上述樣品處理后室溫放置12 h后進樣分析，考察樣品穩定性，結果見表4。

表4 5種代謝物在人肝微粒體孵育體系中的準確度、基質效應、精密度以及穩定性測定結果(n =5)Table 4 The results of accuracy,precision,matrix effect and stability of the five metabolites(n = 5)

2.7 體外孵育試驗

體外孵育試驗設置陽性對照組、空白組、試驗組，每組各平行3組。按“2.5”項下方法制備孵育體系，其中，試驗組的孵育體系中分別加入質量濃度分別為5.0、1.5、0.5、0.15、0.05、0.015、0.005 mmol/L的PT-46溶液使得孵育體系含PT-46的終濃度為 50.0、15.0、5.0、1.5、0.5、0.15、0.05 μmol/L，陽性對照組的孵育體系中分別加入“2.4”項下的α-萘黃銅(CYP1A2)、磺胺苯吡唑(CYP2C9)、(+)-N-3-芐基香酚(CYP2C19)、奎尼丁(CYP2D6)、酮康唑(CYP3A4)特異性抑制劑；空白組孵育體系中加入等體積的PBS緩沖液。測試CYP450特異性底物代謝產物的含量：CYP1A2(對乙酰氨基酚)、CYP2D6(右啡烷)、CYP2C19(5-羥基奧美拉唑)、CYP2C9(羥基甲苯磺丁脲)和 CYP3A4(6β-羥基睪酮)計算出的CYP1A2、2D6、2C19、2C9、3A4的IC50，用以評價化合物PT-46對CYP450 活性的抑制影響。

按“2.5”項下孵育體系進行孵育測定生成的各代謝產物濃度，將其與空白樣品(未添加PT-46的樣品)的代謝的產物濃度進行比較，可以得到酶剩余活性，之后以PT-46濃度為橫坐標，酶剩余活性為縱坐標，運用 GraphPad Prism 5.0軟件進行非線性擬合，作圖并計算出IC50值。IC50=藥物剩余濃度/藥物濃度。

3 結 果

3.1 方法學考察

3.1.1 線性

結果表明，待測物對乙酰氨基酚、右啡烷、5-羥基奧美拉唑、羥基甲苯磺丁脲和內標葛根與空白肝微粒無干擾，專屬性良好。

3.1.2 線性

5種代謝物的線性范圍、線性方程如表3所示，大鼠肝微粒體孵育體系中待測物質的線性關系良好，各成分相關系數(r)均大于0.99。

3.1.3 準確度、基質效應、精密度以及穩定性

結果表明，5種檢測物的準確度范圍86.68%～107.42%，基質效應范圍85.68%～109.88%，穩定性范圍89.14%～99.65%以及精密度RSD小于10.0%，提示該方法準確、可靠、重現性好。

3.2 PT-46對ACYP450 5個亞型的抑制作用

通過PT-46在人肝微粒體體外孵育，得出PT-6對CYP450各亞型的抑制效果。把PT-46的濃度作為橫坐標，酶剩余活性作為縱坐標，用Graphpad Prism 5.0軟件進行非線性回歸的分析，作圖并且計算得到IC50值。酶活性與濃度的擬合圖見圖3，PT-46對人肝微粒體CYP450 5個亞型的IC50值見表5。陽性對照品IC50值的結果見表6。

圖3 PT-46對人肝微粒體中CYP450酶5個亞型的抑制作用Fig 3 Inhibitory effects of PT-46 on five subtypes of CYP450 enzymes in human liver microsomes

表5 PT-46對人肝微粒體CYP450酶五個亞型的IC50值Table 5 IC50 values of PT-46 on five subtypes of human liver microsome CYP450 enzymes

表6 陽性對照對人肝微粒體CYP450酶五個亞型的IC50值，驗收范圍和是否通過Table 6 IC50 values,acceptable ranges and pass of five subtypes of human liver microsomal CYP450 enzymes in positive control

由圖3、表5及表6可知，在測定IC50的實驗中陽性對照組與CYP450的5個亞型的IC50值都在接受范圍當中，由此可顯示實驗中的孵育體系有效。PT-46在給出濃度范圍中對人肝微粒體中CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4沒有抑制作用，對CYP2C9、CYP2C19存在一定的抑制作用，其IC50分別為19.6、19.2 μmol/L。

4 結 論

受代謝酶的影響和控制，藥物在體內的相互作用、藥理活性以及代謝過程等方面存在明顯差異。由藥物代謝引起的藥物-藥物相互作用(Drug-Drug Interaction,DDI)發生率較高，導致嚴重 DDI 原因之一是藥物對 CYP450 酶的抑制作用[12]。近年來，隨著檢測方法的特異性和靈敏度的不斷提高，Cocktail探針藥物法在各個研究領域中的應用越來越廣泛。Cocktail探針藥物法是指給予不同的劑量探針藥物，測定每種探針藥物代謝物生成率的方法[13-14]。優選化合物PT-46具有優異的體外抗腫瘤活性，研究其潛在的DDI效應是非常必要的。本研究對PT-46在肝微粒體中的代謝行為進行了初步探討，采用Cocktail探針藥物法評價了PT-46在人肝微粒體CYP酶亞系中的CYP3A4、2E1、2C19、2C9、1A2的抑制作用，所使用方法靈敏、快速。研究結果顯示，PT-46對人肝微粒體中的2種亞型酶(CYP2C19和 CYP2C9)有著不同程度的抑制作用，并且呈濃度依賴性。該結果提示，在PT-46的后續研發中，應著重關注其與CYP2C19及CYP2C9的底物、誘導劑或者抑制劑同時使用，可能誘發DDI效應。