不同食性野生鳥類腸道微生物研究進展

王 娟,高澤中,蔣一婷,萬冬梅

遼寧大學 生命科學院,遼寧省動物資源與疫病防治重點實驗室, 沈陽 110036

腸道微生物是動物機體內最重要的“微生物器官”,參與個體的營養吸收、代謝調節及免疫功能,在維持生物體健康和適應性進化等方面均發揮著至關重要的作用[1-3]。鳥類是生態系統重要的指示生物,具有豐富的物種多樣性和遺傳多樣性。近年來,隨著分子生物學技術的發展以及對鳥類種群的日益重視,對于鳥類腸道微生物組成及功能等的研究也呈指數增長[4- 5]。然而,受到野外條件下取樣困難、DNA提取量低等因素的限制,研究主要以家禽的研究為主,對于野生鳥類腸道微生物的研究報道則相對較少[3,6-7]。

復雜的生活史特征、多樣化的食性、交配系統、生理特征、飛翔生活、長距離遷徙等使鳥類的生理活動面臨更強的選擇性壓力,使其腸道微生物菌群的變化更加復雜。鳥類腸道微生物組成及多樣性受物種、環境、生活史階段、消化道區域等多種因素的影響[1,4,7-8],特別是食物組成對鳥類腸道微生物的形成具有極其重要的作用[9]。鳥類的食性復雜,如森林鳥類根據食性可分為食果鳥、食蜜鳥、食谷鳥、食蟲鳥、食肉鳥、雜食鳥等類群[10]。其中,食果鳥、食谷鳥、食蜜鳥等均以植物性食物為食；食蟲鳥、食肉鳥、食腐鳥等均以肉食性食物為主要食物來源。而海洋及濕地中的鳥類多為肉食性或雜食性飲食[11]。復雜的食物組成導致鳥類腸道微生物更加復雜多樣。

為了更好的了解不同食性野生鳥類腸道微生物特點,在本研究中,將分別從植食性鳥類、肉食性鳥類和雜食性鳥類的角度出發,對前人的文獻進行全面梳理,分析不同食性的鳥類腸道微生物的組成、特點、影響因素及鳥類腸道微生物研究方法,以期為野生鳥類腸道微生物研究提供參考。

1 野生鳥類腸道微生物與食性關系

1.1 植食性鳥類的腸道微生物研究現狀

目前,關于植食性鳥類腸道微生物研究主要集中于鸮面鸚鵡(Strigopshabroptilus)[12]、北非橙簇花蜜鳥(Cinnyrisosea)[13]、麝雉(Opisthocomushoazin)[14]、安氏蜂鳥(Calypteanna)[15]等種群。

植食性鳥類食物組成較為單一,腸道微生物多樣性相對較低,以高豐富度的變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)為主。此外,在以煙草花蜜為食的北非橙簇花蜜鳥[13]和安氏蜂鳥[15]糞便樣品中均發現了低豐度的放線菌門(Actinobacteria)細菌。

食物組成對植食性鳥類腸道微生物菌群具有重要影響,外源性增加北非橙簇花蜜鳥食物中尼古丁和新煙堿等毒性物質濃度后,其腸道微生物中尼古丁及新煙堿降解菌屬的細菌豐度顯著升高[13]。麝雉具有與反芻動物相似的前腸發酵結構,其腸道內形成與食物消化作用相關的微生物群落,前腸以擬桿菌門(Bacteroidetes)和螺旋體門(Spirochaetes)為主,用于消化纖維素類食物,后腸中以消化蛋白質的變形菌門(Proteobacteria)與厚壁菌門(Firmicutes)為主[14]。

作為新西蘭特有的瀕臨滅絕的植食性鳥類,鸮面鸚鵡腸道微生物組成受到廣泛關注,研究發現,鸮面鸚鵡腸道微生物以費格森埃希菌(Escherichiafergusonii)為主,其分離株具有廣泛的碳水化合物代謝基因,能夠代謝腸道內多種營養物質；該菌株與其他腸道微生物間幾乎無關聯,在不同的環境條件下,均保持鸮面鸚鵡穩定的腸道生態系統[12,16- 17]。為了降低人工喂養的雛鳥的死亡率,養護人員將冷凍的健康成年鸮面鸚鵡糞便懸浮液喂養給圈養的雛鳥。然而,測定發現,冷凍減少了糞便懸浮液中99.86%的菌群豐富,采用冷凍成鳥糞便補充雛鳥腸道微生物豐度的方法是需要進一步考慮的[18]。

1.2 肉食性鳥類的腸道微生物研究現狀

關于肉食性鳥類腸道微生物的研究目前主要集中于王企鵝(Aptenodytespatagonicus)[19]、紋頰企鵝(Pygoscelisantarctica)、白眉企鵝(Pygoscelispapua)[20-21]、小企鵝(Eudyptulaminor)、短尾鸌(Ardennatenuirostris)[22]、家燕(Hirundorustica)[23- 24]、黑頭美洲鷲(Coragypsatratus)、紅頭美洲鷲(Cathartesaura)[25- 26]及部分水鳥[27- 28]。

肉食性鳥類腸道微生物組成中優勢菌集中于厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)。此外,在黑頭美洲鷲、紅頭美洲鷲、小企鵝、王企鵝、紅頸濱鷸(Calidrisruficollis)等肉食性鳥類腸道內發現較高含量的梭桿菌(Fusobacteria)。

目前,肉食性鳥類腸道微生物的研究集中在兩方面內容。一是關于腸道微生物的組成與功效的研究。以腐肉為食的黑頭美洲鷲和紅頭美洲鷲腸道微生物組成和結構異常穩定,以梭菌(Clostridia)和梭桿菌(Fusobacteria)為主要類群,此外,其腸道內也發現了斯特菌抗性細菌等有益微生物基因以及噬菌體、蛭型輪蟲等基因,體現了其腸道微生物對極端飲食的適應[25- 26]。與以野生獵物為食的種群相比,采食牲畜腐肉的赤鳶(Milvusmilvus)種群腸道微生物中沙門氏菌(Salmonellasp.)感染率升高[29]。家燕是重要的食蟲益鳥,在家燕種群中,同巢雛鳥之間、配偶對之間腸道微生物相似性較高,且雛鳥的微生物多樣性高于成鳥[24]；腸道微生物組成與種群“平均腸道微生物”差異較大的成年個體往往具有較低的生存率[23]；種群水平上,具有相似腸道微生物組成的個體,對植物血凝素誘導的免疫反應的相似度較高[30]。

另一方面研究主要集中于生長、發育、換羽、遷徙等生活史過程對鳥類腸道微生物結構的影響[7]。黑腹濱鷸(Calidrisalpina)、半蹼濱鷸(Calidrispusilla)雛鳥出雛前胚胎中微生物數量極少,出雛后腸道微生物發生快速定植,推斷胚胎的內臟很可能沒有微生物存在,腸道微生物很可能是通過環境接種而建立的[31]。短尾鸌發育過程中,腸道微生物群相對較穩定,而小企鵝腸道微生物組成存在顯著的波動,厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)細菌豐度呈顯著上升趨勢,這兩種海鳥的成鳥與雛鳥間腸道微生物區系相似性均較低[22]。換羽禁食期間,王企鵝腸道微生物中梭桿菌門(Fusobacteria)豐富度增加,變形菌門(Proteobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的豐富度下降；小企鵝腸道中厚壁菌門(Firmicutes)豐富度下降,擬桿菌門(Bacteroidetes)豐富度增加[19]；白眉企鵝細菌多樣性顯著增加,不同種群形成不同的細菌群落,腸道微生物的變化受鳥種的影響較大[20]。通過細胞培養法培養隱鹮(Geronticuseremita)微生物樣本,顯示微生物的定植具有明顯的組織趨向性,不同組織間微生物群落差異顯著[32]。對紅頸濱鷸和彎嘴濱鷸(Calidrisferruginea)等遷徙水鳥的研究發現,遷徙個體腸道內放線菌(Actinobacteria)豐度始終高于未遷徙個體,特別是棒狀桿菌屬(Corynebacterium)細菌,其在遷徙個體腸道內豐富度顯著提高[33]。

1.3 雜食性鳥類的腸道微生物研究現狀

目前,對雜食性鳥類腸道微生物的研究多集中于雀形目鳥類[7,34- 35]、雁形目鳥類[36- 37]以及紅嘴山鴉(Pyrrhocoraxpyrrhocorax)[38],翻石鷸(Arenariainterpres)[27]等種群。

雜食性鳥類的食物組成多樣,部分種群食性隨季節發生改變,其腸道微生物組成也相對復雜,以厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)細菌為主[7]。在大山雀(Parusmajor)[39]、加拿大黑雁(Brantacanadensis)[40]、白冠帶鹀(Zonotrichialeucophrys)[41]、針尾鴨(Anasacuta)、綠眉鴨(A.americana)、琵嘴鴨(A.clypeata)、綠頭鴨(A.platyrhynchos)[42]等的腸道內發現了豐富度大于1%的軟壁菌門(Tenericutes)。在斑頭雁(Anserindicus)[43]、白頭鶴(Grusmonachac)[44]、針尾鴨[42]中發現了豐富度大于1%的梭桿菌門(Fusobacteria)細菌。

雜食性鳥類腸道微生物的研究主要集中于三方面內容。首先是人類活動對鳥類腸道微生物的影響。在加拉帕戈斯群島達爾文雀的研究中發現,人類活動地點內的中地雀(Geospizafortis)腸道微生物多樣性降低,與小地雀(Geospizafuliginosa)之間微生物多樣性差異增加[45]。白冠帶鹀腸道微生物多樣性與城市環境中的樹木覆蓋度、防水能力等相關,城市環境中雄性白冠帶鹀腸道微生物多樣性顯著增加[41]。而在家麻雀(Passerdomesticus)的研究中發現,城市化顯著改變了家麻雀腸道微生物的組成,城市環境中的家麻雀腸道內含有更多來自變形菌門(Proteobacteria)的綱級和目級微生物,這些微生物與哺乳動物腸道內多種疾病有關[35]。

其次,宿主遺傳、發育過程、不同腸道區域、食物組成等對鳥類腸道微生物群落結構具有顯著性影響。寄生于喜鵲(Picapica)巢中的大斑鳳頭鵑(Clamatorglandarius)雛鳥腸道微生物結構與巢內喜鵲雛鳥顯著不同,其腸道中含有喜鵲雛鳥與大斑鳳頭鵑親鳥的混合微生物種群[46]。寄生于其它繁殖巢的斑胸草雀(Taeniopygiaguttata)雛鳥腸道微生物與養父母腸道微生物群落結構相似度更高,而人工喂養的斑胸草雀雛鳥腸道微生物的多樣性較低,表明了鳥類雙親在塑造雛鳥腸道微生物多樣性中的重要性[47]。野生家麻雀雛鳥腸道微生物組成隨日齡的增加發生變化,在雛鳥第九天左右,腸腔內變形菌門(Proteobacteria)的豐富度下降,厚壁菌門(Firmicutes)豐富度增加[48]。采用抗生素處理后,家麻雀雛鳥的生長速度和食物轉化效率提高[49]。斑頭雁成鳥泄殖腔微生物組成及多樣性均顯著高于雛鳥,成鳥與雛鳥間微生物結構顯著不同[50]。在加拿大黑雁的研究中發現,同一個體內不同腸道區域微生物區系在豐富度、組成上顯著不同,結腸內微生物豐度最高；不同個體間結腸微生物群落相似性最高,反映了消化道下游微生物群落的物理混合,這也是腸道內不同微生物家族共存的主要原因之一[40]。長江中下游流域越冬的白額雁(Anseralbifrons)、豆雁(Anserfabalis)、鴻雁(Ansercygnoides)的腸道微生物多樣性、群落結構、微生物分子生態網絡的結構等均存在顯著差異,但不同個體腸道微生物中均存在大量參與物質和能量代謝的基因[51]。

此外,一些馴化鳥類的腸道微生物正在得到越來越多的關注[52]。野生西方松雞(Tetraourogallus)腸道微生物以互養菌門(Synergistetes)、放線菌門(Actinobacteria)及梭菌目(Clostridiales)為主,但圈養的個體以γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)細菌為主。人工飼養的斑頭雁腸道微生物中擬桿菌門(Bacteroidetes)豐富度增加,腸道內與碳水化合物轉運和代謝、能量代謝、輔酶轉運等功能相關的微生物基因濃度顯著升高[43]。鴻雁是一種重要的經濟型鳥類,與野生種群相比,養殖鴻雁腸道微生物中梭菌(Clostridium)豐富度降低,SMB53、腸球菌(Enterococcus)、類芽孢桿菌(Paenibacillus)豐富度升高[53]；其血液宏基因組和腸道宏基因組在糖酵解/糖異生、丙酸代謝、檸檬酸循環、淀粉和蔗糖代謝等功能基因上存在廣泛的富集共享[3]。

2 研究方法

野外條件下樣品獲取困難是導致野生鳥類腸道微生物研究較少的主要原因之一[6]。鳥類腸道微生物樣品獲取方法包括致死性采樣和非致死性采樣兩種。致死性采樣是指通過解剖,獲取鳥類不同腸道組織內容物,測定其微生物的組成。該方法可以準確反映鳥類不同腸道區域微生物的組成。但基于對鳥類種群保護的策略,致死性采樣僅用于實驗室條件下樣本的獲取。如在鵪鶉(Coturnixjaponica)的研究中,通過解剖獲得腸道內容物,分析其腸道微生物組成,并探究腸道微生物組成與宿主壓力應激反應間的關系[54]。

泄殖腔拭子、糞便等非致死性樣本是目前鳥類腸道微生物研究的主要樣本來源[1, 4,7,9]。如Corl等[55]采用無菌拭子采集獲得倉鸮(Tytoalba)泄殖腔內微生物樣本。Teyssier等采用無菌磷酸鹽緩沖液沖洗獲得家麻雀泄殖腔微生物樣本[8]。Fu等直接在白頭鶴活動地收集新鮮糞便,分析其腸道微生物組成[56]。非致死性樣本獲取方法簡單,對鳥類個體傷害較小,目前被越來越多的用于野生鳥類腸道微生物研究。但糞便、泄殖腔拭子只能反映鳥類大腸內微生物組成,對個體不同腸道區域微生物組成的反映較差[9]。

野外條件下,樣本的保存同樣是限制鳥類腸道微生物研究的重要因素。為了更準確的反映鳥類腸道微生物的組成,研究者通常采用-80℃液氮或-20℃冰箱保存鳥類糞便或泄殖腔拭子樣本[7,55]。但液氮或冰箱儲存條件增加了野外條件下的工作難度。近年來,乙醇保存的方法逐漸興起,Bodawatta等通過實驗證明,乙醇保存樣本中細菌群落組成與新鮮樣品無顯著性差異,證明該方法確實可行[57]。

此外,基因組DNA的提取和擴增是進行腸道微生物測定的前提。對于小型鳥類,糞便樣品體積較小,DNA的提取量較低,提高PCR準確度及深度對于提高測序精確度具有重要意義。Davidson等采用濾紙片吸附大山雀新鮮糞便樣本中的尿液,降低尿素對DNA擴增的抑制作用,增加基因擴增深度[58]；Luis Víquez-R等采用PNA-DNA夾方法,抑制加島嘲鶇(Mimusparvulus)線粒體DNA或飲食中葉綠體DNA的PCR擴增,增加樣品擴增序列的精確度[59]。

16S rRNA基因測序技術是目前常用的腸道微生物多樣性分析方法[5,7]。該方法測定準確度較高,成本相對較低,被廣泛應用于鳥類腸道微生物研究[3,49,53]。宏基因組測序技術通過對樣品中的全基因組DNA進行高通量測序,分析樣本中微生物的群落結構、基因功能、代謝網絡等信息。目前,該技術也被應用于鳥類腸道微生物分析。如Wang等通過宏基因組測序技術,分析野生及人工養殖的斑頭雁腸道微生物群落結構及基因功能[43]。腸道微生物的培養同樣是分析鳥類腸道微生物組成的重要手段,Lobato等以無菌拭子收集非洲圣多美島的綠棕鶇(Turdusolivaceofuscus)及相鄰加蓬大陸的非洲鶇(Turdusolivaceofuscus)泄殖腔內微生物樣本,采用不同培養基培養后,發現兩者在細菌組成上差異較大,鑒別的14個細菌類群中,僅5種共享,且綠棕鶇種群具有更高豐度的格蘭仕陰性細菌[60]。

3 總結與展望

近年來,隨著基因測序技術的發展及腸道微生物研究方法的逐漸完善,野生鳥類腸道微生物相關研究顯著增加,人們對野生鳥類腸道微生物的組成、結構特征及影響因素有了一定的了解,但目前的研究結果多為描述性研究,缺乏深入作用機制探究。

作為機體內最龐大、最復雜的微生態系統,腸道微生物與動物代謝、免疫防御等息息相關。Hologenome理論認為,微生物群落與其宿主生物體一起進化,在環境脅迫時,有助于提高宿主的生存、表型可塑性和生殖性能等適應參數。鳥類復雜的生活史、食性、婚配體制、飛翔生活等使其面臨較強的選擇性壓力,在這些壓力條件下,鳥類腸道微生物會發生怎樣的調整？其調整的策略及生理機制又是怎樣？在面臨全球氣候變暖的大背景下,野生鳥類腸道微生物又會發生怎樣的變化,以提高個體的適應能力？這些變化對宿主的生存又產生怎樣的影響？這都需要人們深入探究。