PCR?RFLP法檢測MTRR基因A66G多態(tài)位點的改進(jìn)

何震宇 顧取良 陳瑜麗

甲硫氨酸合成酶還原酶又叫5?甲基四氫葉酸?同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶還原酶（5?methyltetrahy?drofolate homocysteine methyltransferase reductase，MTRR），在同型半胱氨酸重新甲基化為甲硫氨酸的過程中發(fā)揮著重要作用，是葉酸代謝網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵酶之一［1］。MTRR基因A66G 多態(tài)性（rs1801394 位點）會引起其編碼的酶蛋白第22 位氨基酸由異亮氨酸變?yōu)榧琢虬彼幔↖22M），導(dǎo)致MTRR 的活性及同型半胱氨酸的甲基化速率降低，從而引起多種相關(guān)疾病的發(fā)生，如唇腭裂［2］、先天性心臟病、無腦兒或者脊柱裂［3］、自然流產(chǎn)［4］、早產(chǎn)［5］、H 型高血壓［6］等。因此，檢測MTRR基因A66G 多態(tài)性，對相關(guān)疾病的發(fā)病風(fēng)險預(yù)測及臨床研究均有重要意義。

目前有多種方法可檢測MTRR基因A66G 多態(tài)性，包括擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)［7］、高分辨率熔解曲線［6］、SNaPshot 測序［8］及聚合酶鏈反應(yīng)?限制性片段長度多態(tài)性（polymerase chain reac?tion?restriction fragment length polymorphism，PCR?RFLP）［2，9］等。本研究旨在對現(xiàn)有檢測MTRR基因A66G 多態(tài)位點的PCR?RFLP 法進(jìn)行改進(jìn)，通過改變引物的設(shè)計，使得野生型等位基因A、突變型等位基因G 來源的PCR 產(chǎn)物均在多態(tài)位點外包含一個NdeI 識別位點，以期將它作為NdeI 酶切的內(nèi)對照從而避免傳統(tǒng)方法因NdeI 酶切不完全即殘留PCR 產(chǎn)物時可能造成的基因型誤判。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

口腔拭子基因組提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye）購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物自行設(shè)計（序列見圖1），委托生工生物工程股份有限公司合成；FastdigestNdeI 購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA MarkerⅠ購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.2 研究對象

口腔拭子標(biāo)本100 例，采自廣東藥科大學(xué)女性志愿者，平均年齡為（21.87±0.58）歲，事先均簽署了知情同意書。

1.3 基因組DNA 的制備

準(zhǔn)備醫(yī)用消毒棉簽，志愿者先用清水漱口，然后手持棉簽伸進(jìn)口腔，在腮幫子上反復(fù)擦拭10次，取出棉簽，按試劑盒的說明書步驟提取基因組DNA。

1.4 引物設(shè)計

根據(jù)NCBI中MTRR基因（登錄號：NG_008856.1）及dbSNP 數(shù)據(jù)庫的相關(guān)序列信息，采用primer pre?mier 5.0 軟件輔以人工修改設(shè)計引物。引物與模板的關(guān)系見圖1，圖中第1 位堿基為NG_008856.1序列中第6712 位堿基，圖中第46 位堿基R（A/G）為多態(tài)位點堿基，上游引物Fo、下游引物Re 分別與基因組序列同向、反向。

圖1 PCR 的模板序列、引物序列及引物與模板結(jié)合位置示意圖Figure 1 Template sequence，primer sequence and primer?template binding location of PCR

1.5 PCR 擴(kuò)增及產(chǎn)物的電泳鑒定

PCR 體系總體積50 μL，其中2×EasyTaq PCR Super Mix 25 μL、上下游引物各10 pmol、基因組DNA 1 μL，ddH2O 補(bǔ)足體積。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，35 個循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.6 PCR 產(chǎn)物的酶切分型

酶切反應(yīng)體系30 μL，其中10×FastDigest Green Buffer 2 μL、FastDigestNdeI 1 μL、PCR 產(chǎn)物5～10 μL、ddH2O 補(bǔ)足體積，37℃水浴消化1 h，然后65℃水浴保溫5 min 以滅活內(nèi)切酶。酶切產(chǎn)物經(jīng)3.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，根椐限制性酶切圖譜中的特征條帶確定每份樣品MTRR基因A66G 多態(tài)位點的基因型。

1.7 測序驗證

挑選本法檢出的3 種基因型樣品，PCR 擴(kuò)增其478 bp 的靶序列委托生工生物工程股份有限公司進(jìn)行序列測定。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 24.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，計數(shù)資料以例數(shù)和頻數(shù)表示，采用χ2檢驗進(jìn)行Hardy?weinberg 遺傳平衡吻合度檢測以確定樣本是否具有群體代表性，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTRR 基因A66G 多態(tài)位點PCR 產(chǎn)物的電泳鑒定

PCR 產(chǎn)物理論大小為478 bp，結(jié)果符合預(yù)期。見圖2。

圖2 改進(jìn)的PCR?RFLP 鑒定MTRR 基因A66G 位點基因型之電泳圖譜Figure 2 The electrophoresis map for identificating genotypes of A66G locus of MTRR gene by improved PCR?RFLP

2.2 MTRR 基因A66G 多態(tài)位點PCR 產(chǎn)物酶切圖譜及基因型判斷

電泳圖譜里只出現(xiàn)363 bp 特征性酶切條帶的為突變型純合子GG 樣品，如圖2中的5 號樣品；只出現(xiàn)318 bp 特征性酶切條帶的為野生純合子AA 樣品，如圖2中的1、4 號樣品；363、318 bp 兩種條帶同時出現(xiàn)時，需區(qū)分雜合子AG 樣品和因酶切不完全殘留363 bp 條帶的野生型純合子AA 樣品，圖2中的3、6、7 號樣品的363 bp 條帶為弱帶或痕量帶，且還伴有痕量的478 bp PCR 產(chǎn)物殘留帶，應(yīng)屬于酶切不完全的情形，故其基因型均為野生純合子AA，相反，圖2中的2 號樣品的兩條條帶均很明顯，363 bp 條帶亮度強(qiáng)于318bp 條帶，樣品的基因型為雜合子AG。見圖3。

圖3 MTRR 基因A66G 位點3 種基因型樣品測序峰圖Figure 3 Sequencing maps of three genotypes of A66G Locus of MTRR gene

2.3 Hardy?Weinberg 遺傳平衡檢驗

本研究檢測到AA、AG、GG 3 種基因型樣品的例數(shù)分別為：57、34、9，相應(yīng)的基因型頻率分別為0.57、0.34、0.09。等位基因A 的頻率為0.74，等位基因G 的頻率為0.26。經(jīng)Hardy?Weinberg 遺傳平衡檢驗，χ2=1.355（P=0.508）。

3 討論

采用PCR?RFLP 法檢測MTRR基因A66G 多態(tài)位點的既有做法是通過錯配上游引物及完全與模板配對的下游引物進(jìn)行PCR，再用限制性核酸內(nèi)切酶NdeI 消化PCR 產(chǎn)物制作酶切圖譜分辨基因型。上游引物3′端倒數(shù)第3 位的錯配堿基C 把基因組原序列AATRTG（R 為多態(tài)位點堿基）改變成PCR 產(chǎn)物中的序列CATRTG，當(dāng)R 為野生型等位基因A 時，其可被NdeI 切割，反之，當(dāng)R 為突變型等位基因G 時，其不能被NdeI 切割。該方法最早可追溯到Wilson A 等的研究［10］，其所用引物擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物長度為66 bp，使用NdeI 消化PCR產(chǎn)物，A 等位基因的PCR 產(chǎn)物會被切割成44 bp 和22 bp 的片段，G 等位基因的PCR 產(chǎn)物不會被切割，仍然保持66 bp 的條帶，Rai V 課題組也曾使用這對引物進(jìn)行研究［11］。由于上游引物需在多態(tài)位點附近引入錯配堿基創(chuàng)造NdeI 酶切位點，其位置基本固定，一些研究人員通過改變下游引物的位置，獲得了比66 bp 更長的PCR 產(chǎn)物用于分型，這些PCR 產(chǎn)物的 長 度為145 bp、151 bp、182 bp 不等［12?14］。所有這些方法獲得的PCR 產(chǎn)物中除了多態(tài)位點相關(guān)序列CATRTG 外，沒有額外的NdeI 識別序列，當(dāng)野生型等位基因A 的PCR 產(chǎn)物沒有被NdeI 完全消化的時候，其殘留的PCR 產(chǎn)物很可能會造成樣品攜帶G 等位基因的假象，基因型AA 樣品會被當(dāng)作基因型AG 樣品對待，這種類似的弊端在針對其他基因多態(tài)位點的PCR?RFLP 分型法中已有報道［15］。

快速限制性核酸內(nèi)切酶（簡稱快酶）FastDigestNdeI 消化PCR 產(chǎn)物的時間≥60 min，而絕大多數(shù)快酶可以在5～15 min 內(nèi)完成對PCR 產(chǎn)物的消化，意味著NdeI 切割PCR 產(chǎn)物的效率相對較低，出現(xiàn)酶切不完全的概率較大，為了避免既有方法因NdeI酶切不完全可能導(dǎo)致的基因型誤判，建立一種監(jiān)測酶切程度的體系很有必要，在PCR 產(chǎn)物中引入內(nèi)對照酶切位點能很好地監(jiān)測PCR 產(chǎn)物是否酶切完全，在其它基因多態(tài)位點的檢測中已有一定的應(yīng)用［16］。本研究結(jié)果表明該設(shè)計既能很好地監(jiān)測酶切是否完全，又能很好地通過特征性酶切條帶來判斷基因型。本研究對上游引物的長度也作出了相應(yīng)的調(diào)整，既有研究的上游引物長度為20～26 nt 不等的普通引物，本研究的上游引物為長達(dá)45 nt 的長鏈引物，其中5′端的CCGGGAGCTGCATGTGT?CAGAGG 為附加序列，它來自通用測序引物pGEX3′，與模板毫不相關(guān)，只起到增加PCR 產(chǎn)物長度的作用，使得表征G 等位基因的特征性酶切條帶（363 bp）與表征A 等位基因的特征性酶切條帶（318 bp）在瓊脂糖凝膠電泳圖譜上有良好的區(qū)分度。下游引物的5′端也附加了一段與模板無關(guān)的序列，它來自通用測序引物CMV?F，旨在縮小上、下游引物退火溫度的差異，從而保證PCR 的效率。

總之，本研究經(jīng)過獨特的引物設(shè)計，成功地在PCR 產(chǎn)物中引入了內(nèi)對照酶切位點，且PCR 產(chǎn)物、表征A 等位基因的特征性酶切條帶、表征G 等位基因的特征性酶切條帶彼此之間具有良好的區(qū)分度，不僅可以監(jiān)測酶切是否完全，而且在酶切不完全的情況下，能夠根據(jù)兩種等位基因的特征性酶切條帶的具體情況判斷樣品的基因型，在相關(guān)的科學(xué)研究和臨床檢測中有一定的推廣應(yīng)用價值。