脂肪間充質干細胞外泌體miR?212?3p對成纖維樣滑膜細胞的影響

賈丙申 于鵬 焦拓 李君 李明 曲國欣 紀志華 付昆

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性全身性自身免疫性疾病。臨床表現為滑膜慢性炎癥性增生和肥大及手足關節損傷［1］。研究證實，成纖維樣滑膜細胞（fibroblast?like synovio?cytes，FLS）在RA 的發病過程中發揮關鍵作用，其增殖和侵襲能力的增強與RA 的發展密切相關［2?3］。因此，探究調控RA?FIS 細胞增殖和侵襲遷移的分子機制對于改善RA 至關重要。近期研究證實，脂肪間充質干細胞（adipose mesenchymal stem cell，ADSC）可通過改變早期適應性T 細胞反應來調節實驗性自身免疫性關節炎［4］；ADSCs 分泌的外泌體能夠降低骨關節炎軟骨細胞的炎癥反應［5］。此外有文獻報道，外泌體miRNAs 在RA 中發揮重要調控作用［6］，miR?212?3p 定位于17p13.3，參與調控多種疾病的發展，且能夠抑制RA?FLS 細胞增殖，促進其凋亡［7］。但鮮有文獻報道ADSC 外泌體對RA?FLS 細胞生物學行為的影響及作用。本研究將從細胞水平探究ADSC 外泌體中miR?212?3p 對RA?FLS 細胞行為的調控及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 標本來源與試劑

收集海南醫學院第一附屬醫院骨科類風濕性關節炎（RA）患者（20 例）和健康者（20 例）血清，患者均已簽署知情同意書，并通過醫院倫理委員會批準。人正常滑膜細胞FLS、人類風濕性關節炎滑膜細胞RA?FLS 和ADSCs 細胞購于北納生物細胞庫。DMEM 和胎牛血清購自美國Biological Indus?tries 公司；Lipofectamine 2000 購于日本TaKaRa 公司；CCK?8 試劑盒購于日本同仁公司；Transwell 小室購買于美國Corning Incorporated 公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于Promega 公司；RT?qPCR引物、antagomiR?212?3p、miR?212?3p mimics 及陰性寡核苷酸由上海吉瑪制藥技術有限公司提供；抗體均購自美國CST 公司。

1.2 ADSCs 細胞培養及外泌體分離

將ADSCs 細胞于含10%胎牛血清的DMEM培養基中培養，或在培養液中加入antagomiR?212?3p；培養24 h 后收集培養液，4℃、800 g 離心10 min 沉淀細胞，再于12 000 g 離心20 min 清除細胞碎片。收集上清，于4℃、100 000 g 離心2 h 收集沉淀，用PBS 洗滌1 次，最后用200 μL PBS 重懸外泌體沉淀，-80℃保存備用。

1.3 RA?FLS 細胞培養及轉染

RA?FLS 細胞培養于含10% 胎牛血清的DMEM 培養基中，然后置于37℃、5%CO2培養箱中進行培養。根據Lipofectamine 2000 轉染試劑說明書分別轉染陰性對照物（NC）、miR?212?3p mimics和si?SMAD1 質粒。分為NC 組：RA?FLS 細胞單獨培養；Exo 組：RA?FLS 細胞+Exo?ADSCs 共培養；Exo?antagomiR?212?3p 組：RA?FLS 細胞+沉默外泌體miR?212?3p 共培養；si?SMAD1+Exo?antagomiR?212?3p 組：敲降RA?FLS 細胞SMAD1+沉默外泌體miR?212?3p 共培養。

1.4 RT?qPCR

采用Trizol 法提取血清及細胞中總RNA，反轉錄成cDNA；用StepOnePlus?儀進行qPCR 反應，以U6 作為內參，反應條件為：95℃30 s，95℃5 s、60℃30 s，循環40 次。實驗重復3 次。結果采用2?ΔΔCt法進行計算。引物序列見表1。

表1 RT?qPCR 引物序列Table 1 The primer sequence for RT?qPCR

1.5 Western blotting

收集并提取各組細胞總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，再進行SDS?PAGE 凝膠電泳，分離目的條帶。用濕式轉移法將蛋白轉印至PVDF 膜上，將PVDF 膜置于5%脫脂奶粉中，室溫封閉1.5 h；加入一抗（1∶1 500），4℃孵育過夜；次日，加入HRP 二抗（1∶3 000），37℃孵育1 h，加入ECL 顯色進行凝膠成像，并用Image J 對蛋白條帶進行定量分析。

1.6 CCK?8

將RA?FLS 細胞以每孔加入100 μL（104個/孔）接種于96 孔板，每孔再加10 μL ADSCs 細胞外泌體懸液。于檢測前1 h，每孔加入10 μL CCK?8溶液混勻，于培養箱中孵育1～4 h。用酶標儀測定450 nm 處的光密度（OD）值。

1.7 Transwell

將密度 為1×105個/mL 細胞懸液和10 μL ADSCs 細胞外泌體懸液接種于預先包被Matrigel基質膠的Transwell 上室。下室加250 μL 含10%胎牛血清的完全培養基，培養48 h，取出小室，棉簽擦去上室細胞，4%的多聚甲醛固定下室細胞15 min，結晶紫染色15 min，PBS 洗凈，干燥后置于倒置顯微鏡下觀察拍照。

1.8 雙熒光素酶報告

根據Starbase 數據庫預測miR?212?3p 與SMAD1 的結合序列，同時構建SMAD1 突變型載體，分別將SMAD1 野生型和突變型載體與miR?212?3p、miR?NC 共轉293T 細胞。按照雙熒光素酶報告基因說明書進行檢測各組熒光素酶活性。

1.9 統計學分析

采用SPSS 20.0 軟件進行數據統計分析，采用GraphPad Prism 7.0 軟件繪圖。所有實驗均重復3次及以上，計量數據采用（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 成功分離ADSCs 細胞外泌體

培養ADSCs 細胞并分離培養液上清中的外泌體，透射電子顯微鏡觀察分離的外泌體（圖1A）。采用Western blotting 檢測發現外泌體特異性標志物CD9、CD63 和CD81 均表達陽性，而陰性標志物CD31 未表達（外 泌體不表達CD31、CD116 和CD34 等內皮性或造血性表面標記物）（圖1B）。

圖1 成功分離的ADSCs 細胞外泌體Figure 1 The exosomes of ADSCs cells were successfully isolated

2.2 ADSCs 細胞外泌體抑制RA?FLS 細胞增殖、遷移和侵襲

在48、72 h 時，Exo 組RA?FLS 細胞增殖活力較NC 組顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）（圖2A）；與NC 組相比，Exo 組遷移和侵襲能力明顯降低（P<0.05）。（圖2B 和2C）。

圖2 ADSCs 細胞外泌體抑制RA?FLS 細胞增殖、遷移和侵襲Figure 2 ADSCs cell exosome inhibited the proliferation，migration and invasion of RA?FLS cells

2.3 ADSCs 細胞外泌體上調RA?FLS 細胞中miR?212?3p 的表達

與NC組相比，Exo組中miR?708?5p、miR?212?3p、miR?650 及miR?92a 的表達水平均顯著上調，差異有統計學意義（P<0.05）。（圖3A）。miR?212?3p 在RA 患者血清中的表達水平顯著低于健康組血清，差異有統計學意義（P<0.05）。（圖3B）。

圖3 ADSCs 細胞外泌體上調RA?FLS 細胞中miR?212?3p的表達Figure 3 ADSCs cell exosome upregulated the expression of miR?212?3p in RA?FLS cells

2.4 miR?212?3p 靶向下調SMAD1 的表達

與NC 組相比，miR?212?3p mimics 與SMAD1?Wt 質粒共轉293T 細胞時熒光素酶活性顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）（圖4A）；而miR?212?3p mimics 與SMAD1?Mut 質粒共轉時熒光素酶活性與NC組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。miR?212?3p過表達組中SMAD1 的表達水平顯著低于NC 組，差異有統計學意義（P<0.05）。（圖4B）。

圖4 miR?212?3p 靶向下調SMAD1 的表達Figure 4 miR?212?3p targeted downregulate the expression of SMAD1

2.5 ADSCs 細胞外泌體miR?212?3p 通過SMAD1抑制RA?FLS 細胞增殖、遷移和侵襲

與NC 組，Exo 及si?SMAD1+Exo?antagomiR?212?3p 組中SMAD1 的表達水平比較，差異均有統計學意義（P<0.05），Exo?antagomiR?212?3p 組中SMAD1 表達水平，差異無統計學意義（P=0.657），見圖5A。與NC 組，Exo 組及si?SMAD1+Exo?an?tagomiR?212?3p 組RA?FLS 細胞遷移數和侵襲數均顯著降低（P<0.05），Exo?antagomiR?212?3p 組中RA?FLS 細胞遷移數和侵襲數較NC 組，差異無統計學意義（P>0.05），見圖5B、圖5C 和表2和表3。CCK?8 結果顯示，處理24 h 時，各組之間差異無統計學意義；而當處理48 h 與72 h 時，相比于NC 組，Exo及si?SMAD1+Exo?antagomiR?212?3p 組RA?FLS 細胞活力顯著降低，而Exo?antagomiR?212?3p 組中RA?FLS 細胞活力比較差異無統計學意義（P>0.05），見表2。

表2 Transwell 實驗結果（±s）Table 2 Transwell experimental results（±s）

表2 Transwell 實驗結果（±s）Table 2 Transwell experimental results（±s）

組別遷移細胞數/視野t 值P 值侵襲細胞數/視野t 值P 值NC 253±19 si?SMAD1+Exo?antagomiR?212?3p 207±23 Exo 159±14 15.22 0.002 126±18 16.67 0.006 Exo?antagomiR?212?3p 236±17 17.23 0.977 198±20 21.24 0.700 176±20 19.76 0.004 115±26 24.88 0.004

表3 CCK?8 實驗結果（±s）Table 3 CCK?8experimental results（±s）

表3 CCK?8 實驗結果（±s）Table 3 CCK?8experimental results（±s）

組別細胞增值活力（OD450）t 值P 值si?SMAD1+Exo?antagomiR?212?3p 24 h 48 h 72 h NC 0.56±0.19 0.78±0.12 0.87±0.15--Exo 0.53±0.14 0.6±0.18 0.78±0.14 1.043 0.007 Exo?antagomiR?212?3p 0.55±0.15 0.77±0.11 0.84±0.13 1.267 0.856 0.54±0.14 0.67±0.15 0.76±0.14 1.056 0.006

圖5 ADSCs 細胞外泌體miR?212?3p 下調SMAD1 抑制RA?FLS 細胞增殖、遷移和侵襲Figure 5 ADSCs cell exosome miR?212?3p inhibited the proliferation，migration and invasion of RA?FLS cells by downregulating SMAD1

3 討論

RA 已成為最常見的結締組織疾病之一。其主要病理改變為滑膜組織增厚，大量炎性細胞浸潤，間質嚴重水腫，嚴重破壞關節軟骨和骨骼，以及血管生成。RA 已成為致殘和喪失勞動力的主要原因之一［8］。RA?FLS 細胞是參與RA 滑膜組織發展的主要細胞群，在RA 發病機制中起著至關重要的作用，有助于類風濕血管的形成［9］。有文獻報道，通過體外擴增培養自體ADSCs 細胞及全身輸注，能夠治療自身免疫性疾病，如多發性硬化、多發性肌炎和RA 等［10］。此外有文獻證實，ADSCs細胞來源的外泌體在疾病發展過程中扮演著重要角色。例如，在乳腺癌細胞模型中，ADSCs 細胞外泌體通過Wnt 信號通路促進乳腺癌細胞遷移［11］。本研究發現，ADSCs 細胞來源的外泌體能夠抑制RA?FLS 細胞增殖、遷移和侵襲。

研究證實，ADSCs 細胞來源的外泌體中含有豐富的miRNAs，并在疾病發展過程中發揮重要調控作用。例如，人ADSCs 細胞來源的外泌體miR?NAs 是誘導A2780 和SKOV?3 卵巢癌細胞抗增殖信號轉導的關鍵因子［12］。同時研究證實，miRNAs在RA 的發展過程中具有重要調控作用。例如，miR?124a 靶向PI3K/NF?κB 通路抑制RA?FLS 細胞增殖和炎性反應［13］；miR?506 通過靶向下調TLR4抑制RA?FLS 細胞增殖，且誘導凋亡［14］；miR?320a靶向MAPK?ERK1/2 信號通路抑制RA?FLS 細胞增殖［15］。有研究報道，miR?212?3p 在RA 患者滑膜組織、血清和RA?FLS 細胞中低表達，過表達miR?212?3p 能夠顯著抑制RA?FLS 細胞增殖［7］。本研究的結果與以前的研究結果相似，發現miR?212?3p 在RA 患者血清中低表達。此外，本研究發現ADSCs 外泌體能夠通過提高RA?FLA 細胞miR?212?3p 的表達水平抑制RA?FLS 細胞增殖、遷移和侵襲，而敲降miR?212?3p 后，能夠回復ADSCs外泌體對RA?FLS 細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。這說明ADSCs 細胞通過分泌外泌體miR?212?3p 上調RA?FLS 細胞中miR?212?3p 的表達，進而抑制RA?FLS 細胞惡性生物學行為。

SMAD1 蛋白是SMADs 細胞質蛋白家族重要成員，是TGF?α/SMADs 信號通路的重要遞質。Chen 等人［16］研究表明，SMAD1 在前列腺癌中高表達，抑制SMAD1 的表達可抑制前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。本研究發現，miR?212?3p 可靶向結合SMAD1 的3′UTR；同時，回復實驗證實，miR?212?3p 通過靶向下調SMAD1 進而抑制RA?FLS 細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，miR?212?3p 在ADSCs 細胞外泌體中高表達，ADSCs 細胞通過分泌外泌體miR?212?3p上調RA?FLS 細胞中miR?212?3p 的表達水平，且靶向下調SMAD1 的表達水平，進而抑制RA?FLS 細胞增殖、遷移和侵襲。