阿爾茨海默病早期診斷及新技術展望

紜玲 高洪梅 李碩 楊爍 王海濤 崔慧娟 劉煥亮 付源★

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是一種以進行性記憶喪失和認知功能障礙為特征的神經退行性疾病［1］。細胞外β?淀粉樣蛋白（amyloid beta，Aβ）沉積，細胞內神經原纖維纏結（Neurofibril?lary tangles，NFTs）伴神經元丟失及膠質細胞活化是AD 病理特征［2］。流行病學調查顯示65 歲以上人群中每10 人就有一人患病，85 歲以上人群中每3 人就有1 個患者［3］。AD 已成為全球嚴重的醫療和社會問題之一，給社會和家庭造成了沉重的負擔。目前對AD 尚無有效治療方法，而早期診斷AD 有助于早期干預及延緩疾病進展。生物化學改變發生于臨床癥狀出現前20年，所以檢測生物標志物是AD早期診斷的重要工具［4］。本文就AD 早期分子診斷研究進展進行綜述，以幫助早期治療、早期預防。

1 基因檢測

AD 根據發病年齡分為早老性AD（early?onset AD，EOAD）與遲發型AD（late?onset AD，LOAD），EOAD 占所有AD 病例5%以下，LOAD 占所有AD病例的95%以上［5］。研究發現EOAD 主要由β?淀粉樣蛋白前體（APP）、早老素?1（PSEN1）和早老素?2（PSEN2）基因突變引起，這些錯義基因可協助早期診斷AD［6］，其突變之后可導致腦組織發生氧化損傷，引起腦內Aβ 的產生和清除的失平衡，進而形成Aβ 異常沉積所形成的老年斑（Amyloid Plaque），最終出現神經元凋亡［7］。基因突變的分類目前仍然具有挑戰性，多項研究發現不同EOAD患者體內存在多個突變，如PSEN1的兩個新突變（Y256N 和H214R）、致病性PSEN1Trp165Cys 突變、PSEN1G209A 突變，這些基因突變位點的篩查可為臨床早期診斷AD 提供突變序列，未來還將從蛋白質組學、轉錄組學技術同步檢查，并整合這兩個組學分析的數據進一步研究其可能的致病機制［8?11］。

載脂蛋白E（Apolipoprotein E，APOE）基因被廣泛認為是LOAD 的易感基因，其中APOE ε4等位基因是LOAD 發病的最強風險因素，與AD 大腦中Aβ 異常沉積密切相關［12］。攜帶APOE ε4基因亞型的AD 模型小鼠腦內Aβ 的異常沉積主要發生在Aβ 形成早期，而不影響中晚期Aβ 沉積［13］。脂質化apoE 與Aβ 競爭性結合細胞膜表面HSPG 受體，抑制神經細胞攝取Aβ，導致Aβ 清除減慢，此作用具有濃度依賴性［14］。APOE ε4轉基因小鼠中炎癥因子環孢素A 和基質金屬蛋白酶?9 通過加速血腦屏障周細胞的降解，引起血腦屏障破壞，進而影響血腦屏障介導的外源性Aβ 的清除［15］。此外，APOE ε4激活Erk 途徑、降低細胞自噬清除tau 蛋白、誘發腫瘤壞死因子?α 分泌產生炎癥反應等途徑加劇tau 蛋白異常磷酸化，導致神經元退行性改變［16］，這些關鍵的病理變化可協助早期篩查LOAD 患者。

全基因組關聯研究證實了CD33基因與AD 發病具有關聯性，其表達的CD33 蛋白在大腦中主要由小膠質細胞表達，對小膠質細胞介導的Aβ 的攝取發揮抑制作用，是LOAD 易感基因位點，利用靜息狀態功能磁共振成像發現CD33基因型主要影響額葉?紋狀體環路中腦功能，在海馬旁回中也觀察到CD33基因型和AD 之間存在相互作用，這些發現為CD33基因型對認知功能的影響提供了進一步的見解［17?18］。此外，還有研究發現攜帶微管相關蛋白tau（Microtubule?associated protein tau，MAPT）基因患者腦脊液t?tau 和p?tau 水平顯著增加，表明MAPT基因可作為早期診斷AD 有效的篩查基因，但仍需要進一步明確其基因多態性與AD 發病風險的相關性［19］。所以驗證這些基因準確預測疾病發生的能力并明確可能的致病機制非常重要。

2 生物學標志物檢測

AD 相關生物學標志物檢測主要以腦脊液檢查為主，隨著技術手段的進步，在外周血液等其他組織也正在試圖尋找簡便有效的早期診斷生物標志物。根據國際工作組織和美國國立老化研究院建立的診斷標準，腦脊液Aβ1?42水平下降、總tau、磷酸化tau 水平上升被認為是有效的AD 支持性診斷標準之一。Lewczuk 等人［20?21］報道腦脊液中Aβ42 降低對AD 診斷的敏感性為69.3%，特異性則可達到88.9%，Aβ42/Aβ40 降低的敏感性和特異性分別為93.3%和100%，在臨床常規條件下腦脊液Aβ42/Aβ 40 代替Aβ42 可以提高診斷準確性，然而腦脊液生物標志物的可變性太高（包括運輸、實驗方法、參考值等的影響），臨床界限值確定存在較大困難，下一步需要標準化實驗室條件，識別和連續優化影響因素。Aβ1?42和p?tau 是腦脊液生物學標志物的最佳組合，可以預測輕度認知功能障礙患者發生AD 的總體風險，有利于對AD 患者進行早期干預［22］。視錐蛋白樣蛋白1（Visinin?like protein?1，VILIP?1）是一種神經元內鈣傳感蛋白，在腦損傷模型和基因陣列分析中已被證實可作為神經元損傷的指標，其可作為神經元丟失病理過程的累積結果。因此，捕捉神經元變性丟失的腦脊液標志物可能對未來的認知下降提供預測價值。據此，有研究發現腦脊液VILIP?1 水平與情景記憶和語義記憶能力下降有關，與AD 早期顳葉內側萎縮病理改變具有一致性，CSF 中VILIP?1和VILIP?1/Aβ42 可作為早期AD 患者認知功能下降的預測模型，其作用與tau 和tau/Aβ42 類似，可能成為AD 早期神經變性的有效CSF 替代物［23］。

由于腦脊液檢測的有創性和普及難度大，而血液采集具有極大的簡便性，大家開始把目光轉向血液生物標志物。由于血漿中Aβ 的含量較低，且干擾測量的特定血液蛋白質和其他化合物含量過高，其免疫測量和定量受到阻礙。在極輕微AD、輕度認知功能障礙（Mild cognitive impair?ment，MCI）和健康對照組的血漿中檢測t?tau 和p?tau蛋白水平，發現極輕微AD 和MCI 患者血漿t?tau和P?tau 水平高于健康對照組，極輕微AD 患者血漿t?tau 和p?tau 水平高于MCI 組，并且p?tau 相關性更顯著，表明血漿t?tau 和p?tau 均可協助篩查早期AD，但血漿p?tau 水平與AD 嚴重程度相關性高于血漿t?tau［24］。此外，有研究還發現血清t?tau 和p?tau181 蛋白水平與蒙特利爾評分呈負相關，此結果支持血液t?tau 和p?tau 作為早期AD 的預測標志物，有可能作為未來隨訪AD 患者預后的指標［25］。分析MCI 和AD 患者血漿Micro RNA 轉錄組，microRNA?206 表現出與認知能力下降和記憶缺陷的強烈相關性，五年以上的縱向隨訪發現，microR?NA?206 在認知功能障礙發生之前異常增加，可用于預測MCI 階段認知能力的下降［26］。

唾液生物學標志物檢測是一種比血液更為簡便的方法，利用高度敏感的Luminex 分析法對唾液t?tau、p?tau 和Aβ42 蛋白水平進行定量評估，結果顯示AD 患者的p?tau/t?tau 比值顯著增加，在S396 磷酸化位點變化更明顯［27?28］。這些結果表明，唾液tau 蛋白可能成為AD 早期診斷的生物學標志物，甚至可應用于無癥狀受試者的篩查，進而為AD 治療提供更大的時間窗［29］。此外，研究還顯示AD 患者的唾液Aβ42 水平明顯高于對照組［30］。綜上所述，唾液檢測可成為AD 早期診斷的關鍵方法。下一步有必要進一步了解這些生物標志物的聯用優勢，進行大樣本數據驗證及建立可靠的臨界值和標準參考物。

3 影像學檢查

影像學技術發展對AD的診斷和預后判斷具有重要意義。AD 患者磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging，MRI）檢查的主要改變是皮質性腦萎縮和腦室擴大伴腦溝裂增寬，但由于缺乏對AD 診斷的特異性，主要用于排除可引起癡呆的其他疾病。定量磁化率成像是磁共振成像中一項新興的用于定量測量組織磁化特性的技術，利用該技術證明Aβ 具有抗磁性，可在磁化率圖上產生強烈的對比，磁化率標測可以用來檢測AD 小鼠模型中Aβ 斑塊的聚集［31?32］。

正電子發射斷層掃描淀粉樣蛋白顯像劑與大腦內纖維狀淀粉樣蛋白沉積的結合，可視化和量化大腦內淀粉樣蛋白沉積，可檢測AD 患者大腦內Aβ 異常沉積，主要配體包括11C 和18F 標記的放射性示蹤劑［33］。利用突觸囊泡糖蛋白2A PET 顯像測定突觸密度，可為阿爾茨海默病的早期診斷提供工具［34］。氟?2?脫氧?D?葡萄糖?正電子發射斷層掃描成像顯示，顳頂葉、額葉和后扣帶皮質中的葡萄糖代謝減少是AD 的標志，中晚期出現額葉皮質受累，額葉受累與否，可作為鑒別AD 早期和中晚期的標志［35］。應用單光子發射計算機斷層掃描（Single Photon Emission Computed Tomography，SPECT）技術評估腦灌注變化，發現≥94%輕度AD患者的灌注值低于健康對照組的平均值，這一結果提示繪制低灌注的地形圖，可明確特定的早期灌注模式，幫助早期診斷AD［36］。由于目前還沒有確切規范的測量標準及相關案例較少，下一步需要建立供臨床使用的標準并培訓閱片人。

4 新技術展望

隨著視覺變異型AD（Visual variant of AD，VVAD）患者的發現，眼部標志物逐漸進入研究者的視線，有研究團隊發現AD 神經病理學包括視網膜Aβ、tau 蛋白的積聚、神經元丟失和RGC 凋亡，在AD 模型小鼠中發現其視網膜RGCc 層凋亡細胞的存在，視網膜凋亡細胞檢測技術是一種利用放射性annexin V 和聚光共聚焦掃描眼底鏡檢測凋亡細胞的方法，可以在AD患者中無創性顯示AD病理變化，這種成像技術的演變和發展可成為未來的AD診斷工具［37?38］。

生物傳感器是一種對生物物質敏感并將其濃度通過識別元件識別后經換能器轉換為光、電等可測量信號進行檢測的儀器，因其快速、低廉、簡便、可重復使用等優點成為診斷很多疾病的有前途的工具［39］。一種用于檢測Aβ 蛋白的免疫磁生物傳感器，利用sulfo?SMCC 交聯法將抗Aβ 抗體標記在磁性氮摻雜石墨烯表面，形成磁性免疫載體，將磁性免疫載體放置在Au 電極上，在電極下方放置一個外部磁鐵進行電化學Aβ 檢測，通過電流變化測定Aβ 蛋白濃度，該儀器目前只在體外實驗進行驗證，未來可考慮對AD 患者腦脊液、血液Aβ 蛋白濃度進行測定，對AD 早期診斷有潛在的作用［40］。雖然這些技術優勢顯而易見，但同時也需要解決可再生性、特異性、穩定性等方面的問題，才可能使其成為未來的有效診斷工具。

5 結語

AD 目前尚無有效的治療手段，早期診斷和干預是控制AD 發生發展的重要措施。建立有效的分子診斷標志物是AD 研究領域的重要難題。隨著醫療新技術的不斷發展，進一步發現有良好重復性及有效性，確立簡便、易行的診斷方法，將會為AD 診斷指明新方向。