p33ING1、PDGF?A及bFGF在ARC患者晶狀體上皮細胞中的表達及臨床意義

郭清

白內障為晶狀體發生混濁，阻礙光線進入眼內，從而對視力造成影響的一種眼病［1］。年齡相關性白內障（age?related cataract，ARC）發生頻率較高，是導致老年人盲目的主要原因［2］。近年來，國內外學者均從靜態到動態對晶狀體的相關化學成分、含量和代謝進行了大量研究，但迄今為止有關ARC 的發病機制仍未完全清晰。生長抑制因子1（inhibitor of growth 1，INGl）定 位 于 人 染 色 體13q33?34，其編碼的蛋白產物為核蛋白［3］。INGlmRNA 有INGla、INGlb、INGlc 多種不同的變位剪接模式，編碼著p47INGla，p33INGlb，p24INGlc三種不同的蛋白質［4］。有研究認為p33INGl的過表達可促進由“血清饑餓"誘導的細胞凋亡，但關于其與ARC 的關系鮮有報道［5］。堿性成纖維細胞生長因子（ba?sic fibroblast growth factor，bFGF）存在于多種動物和人的眼組織中，近來研究發現其與白內障關系密切［6］。血小板源性生長因子A（Platelet derived growth factor?A，PDGF?A）作為一種由多種細胞產生分泌的活性多肽，與多種眼科疾病的關系一直是臨床關注焦點［7］。本研究就p33ING1、PDGF?A 及bFGF 在年齡相關性白內障患者晶狀體上皮細胞中的表達及臨床意義進行分析，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 基線資料

選取2018年4月至2019年4月本院收治的67例ARC 患者作為ARC 組，其中男37 例，女30 例，平均年齡（69.31±5.44）歲。納入標準：（1）符合ARC 的診斷標準［5］：①年齡在50 歲及以上者；②使用晶狀體混濁分級系統Ⅱ（lens opacity classifica?tion system Ⅱ，L0CS Ⅱ）［8］確定為皮質型晶狀體混濁、核型晶狀體混濁和后囊下型晶狀體混濁，并排除對視力無影響的點狀混濁；③日常生活視力在0.7 以下；④白內障手術后人工晶狀體和無晶狀體眼者或患者雙眼中有1 眼滿足ARC 診斷標準也可診斷為ARC。⑤納入研究前1 個月內未服用過影響激素水平、免疫功能的藥物。排除標準：①視力下降原因包括角膜疾病、眼底疾病等的患者；②精神系統異常者；③依從性差者。

對照組選取同期來院進行準分子激光屈光性角膜切削術治療的近視者70 例，39 例，女31 例，平均年齡（68.45±5.41）歲。納入標準：①眼部功能無異常，無任何眼部疾病；②最佳矯正視力在0.5 及以上者；③晶狀體無混濁。所有標本的采集均獲得患者本人同意并簽署知情同意書，本研究經醫院倫理委員會批準通過。ARC 組與對照組基線資料比較差異無統計學意義（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 晶狀體上皮細胞前處理

采用連續環形撕囊法取下ARC 組和對照組人晶狀體直徑約為5 mm 內的前囊膜，95%NaCl 溶液沖洗好后，置于EP 管，保存于-80℃冰柜中備用。

1.2.2 p33ING1、PDGF?A 及bFGF 檢測

采用實時熒光定量PCR 法進行檢測：取上述液氮保存的晶狀體上皮細胞組織，按照Trizol 試劑盒說明書操作提取組織總RNA，按照miRNA 反轉錄試劑盒操作步驟將2 μg RNA 反轉錄為cDNA，之后按照SYBR Green RCR master mix 試劑說明配反應體系并加樣。RT q?PCR 反應體系共為20 μL：SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）10 μL，cDNA 2.0 μL，上下游引物各0.8 μL，ROX Reference DyeⅡ（50×）0.4 μL，雙蒸水ddH2O 6.0 μL。完成后將其放入熒光定量PCR 儀上進行反應，程序設定為：95℃5 s，95℃15 s，60℃30 s，72℃15 s，共41 個循環，72℃終延伸10 min。反應結束后整理數據，并對所得數據Ct 值進行分析，采用2ΔCt［14］算法計算p33ING1、PDGF?A及bFGFmRNA的相對表達量［9］。

1.3 氧化應激因子水平測定

取出提前備好的標本，分離3 mm×3 mm，加入磷酸緩沖液（pH 7.3），渦旋震蕩，-4℃環境下進行離心。檢測指標為丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxi?dase，GSH?Px），檢測方法為酶聯免疫吸附試驗。

1.4 統計學方法

應用SPSS 20.0 統計學軟件進行分析，計量資料以（±s）表示，行t檢驗；相關性采用Pearson分析，以P<0.05 為差異有統計學意義。

2。結果

2.1 ARC 組與對照組p33ING1、PDGF?A 及bFGF mRNA 表達比較

ARC 組p33ING1表達水平低于對照組，PDGF?A及bFGFmRNA 表達水平高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 兩組p33ING1、PDGF?A 及bFGF mRNA 表達水平比較（±s）Table 1 Comparison of p33ING1，PDGF?A and bFGF mRNA expression levels between 2 groups（±s）

表1 兩組p33ING1、PDGF?A 及bFGF mRNA 表達水平比較（±s）Table 1 Comparison of p33ING1，PDGF?A and bFGF mRNA expression levels between 2 groups（±s）

組別ARC 組對照組t 值P 值n 67 70 p33ING1 mRNA 0.44±0.13 0.87±0.21 14.335<0.001 PDGF?A mRNA 1.06±0.25 0.54±0.13 15.368<0.001 bFGF mRNA 265.62±15.18 134.09±14.07 52.627<0.001

2.2 ARC 組與對照組氧化應激水平比較

ARC 組GSH?Px 水平低于對照組，MDA 水平高于對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 ARC 組與對照組氧化應激水平比較（±s）Table 2 Comparison of oxidative stress level between arc group and control group（±s）

表2 ARC 組與對照組氧化應激水平比較（±s）Table 2 Comparison of oxidative stress level between arc group and control group（±s）

組別ARC 組對照組t 值P 值n 67 70 MDA（μmol/mg）18.09±2.34 6.98±1.13 35.624<0.001 GSH?Px（μmol/g）0.36±0.04 0.87±0.08 46.869<0.001

2.3 ARC 患者p33ING1、PDGF?A 及bFGF mRNA 表達與氧化應激水平的相關性

ARC 患者p33ING1mRNA 表達與GSH?Px 水平呈正相關關系（P<0.05），與MDA 水平呈負相關關系（P<0.05）；PDGF?A及bFGFmRNA 表達水平與GSH?Px 水平呈負相關關系（P<0.05），與MDA 水平呈正相關關系（P<0.05）。見表3。

表3 ARC 患者p33ING1、PDGF?A 及bFGF mRNA 表達與氧化應激水平的相關性分析Table 3 Correlation Analysis of p33ING1，PDGF?A and bFGF mRNA expression and oxidative stress level in patients with ARC

3 討論

ARC 發生機制十分復雜，雖然通過手術能很好地使該癥患者恢復視力，但是在疾病發展和治療過程中，可導致多數患者的生活質量明顯下降。同時由于手術潛在的風險也給患者帶來了嚴重的身心負擔，因此更全面更深入地探討該病的病因及防治方法顯得尤為迫切［10］。晶狀體接受外界環境影響最早的部位是位于晶狀體前囊下的晶狀體上皮細胞，當此類細胞發生改變的同時也會誘發晶狀體發生改變，相關學者認為ARC 的發生與此類細胞的改變有很大程度的關聯性［11?12］。

在一例紫外線、H2O2及鈣離子載體引導的白內障晶狀體離體實驗中，發現了晶狀體上皮細胞中存在著大量的凋亡細胞，這一發現有力地佐證了晶狀體上皮細胞的凋亡可能是各種白內障發生的共同細胞學基礎這一理論［13］。p33ING1是近年來新發現的一種生長抑制基因，具有促進細胞凋亡、抑制細胞生長的作用［14］。研究發現，p33ING1表達受抑制將增加NIH3T3 細胞的集落形成、延長二倍體成纖維細胞的生存時間［15］。而p33ING1表達下調則可抑制細胞凋亡，控制細胞生長速度，并促進細胞逃離生長監控，導致細胞過度增生而發生病變。本研究中可見ARC 患者晶狀體上皮細胞中p33ING1mRNA 呈低表達，p33ING1mRNA 與GSH?Px 水平呈正相關，與MDA 水平呈負相關，與既往文獻報道結果相一致［16］。提示p33ING1mRNA 可能參與ARC 晶體混濁的過程。

PDGF?A 是功能最強的生長因子之一，其通過自分泌或旁分泌調節，對多種疾病的進展至關重要，并與患者不良預后相關。文獻指出，正常人房水內PDGF?A 主要功能是維持晶狀體上皮細胞的正常增殖和分化，為晶狀體實現正常功能提供基礎［17］。本研究中，ARC 患者PDGF?A水平高于對照組，PDGF?A水平與GSH?Px 水平呈負相關，與MDA 水平呈正相關。PDGF?A 通過影響晶狀體上皮細胞質內鈣離子的濃度實現對晶狀體上皮細胞的調節，而一旦PDGF?A 濃度發生異常，其將發揮有絲分裂作用導致晶狀體上皮細胞不正常的增殖［18?19］。因此，可以推測PDGF?A的水平及分布不正常很可能是導致晶狀體上皮細胞發生異變，導致白內障發生的原因之一。

本研究結果中，ACR 患者晶狀體上皮細胞中PDGF?AmRNA 水平的表達顯著升高，且PDGF?AmRNA 表達水平與GSH?Px 水平呈負相關關系，與MDA 水平呈正相關關系，可見PDGF?AmRNA 與ARC 的發生關系密切，并發揮了重要作用。晶狀體代謝過程中會通過多種方式分泌一些細胞因子，彌補氧化應激對其造成的傷害，進而為細胞的正常生長、分化提供支持，在這些細胞因子中p33ING1、PDGF?A及bFGFmRNA 的價值和地位不容小覷，三者有望成為評價ACR 發生、病情進展的標志性指標。

綜上所述，p33ING1、PDGF?A及bFGFmRNA 水平在ARC 患者晶狀體上皮細胞中呈異常表達，三者水平與ARC 患者氧化應激呈明顯相關性，檢測其水平有利于臨床病情評估。