良惡性腎上腺嗜鉻細胞瘤VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR表達差異及與患者預后的關系

呂蘇一 張磊 李山成

腎上腺嗜鉻細胞瘤（Pheochromocytoma，PCC）是腎上腺較為常見腫瘤，由于其良、惡性具有相似臨床表現、組織學形態及超微結構，故鑒別難度較大，嚴重影響臨床制定針對性治療方案及預后改善［1?3］。因此，準確鑒別腎上腺PCC 性質是目前臨床亟需解決的問題。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是最為強烈的血管通透性因子，可誘導新生血管生成，參與腎細胞癌［4］、宮頸癌［5］等多種惡性腫瘤病理進程。黑色素A（melanA）是惡性黑色素瘤特異性免疫指標，在腎細胞癌中呈低表達。另有研究表明［6］，長鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA，lncRNA）在腫瘤細胞增殖、遷移、凋亡和自噬調控中亦起著重要作用。HOX 基因的反義基因間RNA（HOX transcript anti?sense intergenic RNA，HOTAIR）是第一個臨床發現的lncRNA，具有反式轉錄調控基因表達作用，在肝癌［7］、胃癌［8］等增殖、浸潤及轉移中的作用已被臨床證實。本研究嘗試探討良惡性PCC 患者VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表達差異及對患者預后的影響，旨在為臨床診治、預后評估提供潛在途徑。報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選取2017年2月至2020年2月肥城查莊礦醫院腎內科收治的69 例惡性PCC 為惡性組，33 例良性PCC 為良性組，采集手術切除的良惡性PCC 組織標本。其中惡性組男42 例，女27 例，平均年齡（43.82±3.04）歲；良性組男20 例，女13 例，平均年齡（44.19±2.85）歲。納入標準：①兩組均經手術病理組織學確診；②所有研究對象均簽署知情同意書；排除標準：①術前有放化療、激素治療史者；②合并心腦等其他重要臟器器質性損害者；③合并自身免疫系統疾病或全身感染性疾病者；④合并其他部位惡性腫瘤者；⑤語言與聽力功能障礙或精神行為異常者。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法

采集手術切除的良惡性PCC 組織標本（3 cm×3 cm）：①使用中性福爾馬林（4%）固定，石蠟包埋，連續切片，首先采用抗體染，出現棕色，后用蘇木素染核染藍色。采用免疫組織化學法試劑盒檢測VEGF、melanA 表達。結果判定［9］：每張切片均由具備豐富經驗的2 名病理醫師根據染色范圍與染色強度評分進行判斷，VEGF、melanA 陽性均以高倍顯微鏡下細胞質或細胞膜產生棕黃色或棕褐色顆粒沉著為準，其中染色范圍分為1 分、2 分、3 分、4 分；染色強度分為0 分（與背景接近）、1 分（稍微高于背景色）、2 分（顯著超過背景色）、3 分（出現深棕黃色）。染色范圍、染色強度評分結果相加，0～3 分為陰性，>3 分為陽性。②采用實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應試劑盒檢測LncRNA HOTAIR 表達，根據Ct 值判定檢測結果，其中Ct 值<26 為陽性，26≤Ct 值<29 為弱陽性，Ct 值≥29 為陰性。

1.2.2 治療方法

PCC 患者行腹腔鏡手術治療，惡性患者手術切除腫瘤后4 周接受輔助治療或化療。

1.3 統計學方法

采用統計學軟件SPSS 22.0 處理數據，計數資料用n（%）表示，行χ2檢驗；VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表達與惡性組病理特征的相關性分析采用Spearman 相關系數模型；VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表達對良惡性腎上腺PCC 的鑒別價值分析采用受試者工作特征（ROC）曲線；VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表達與惡性腎上腺PCC 患者1年生存率的關系采用卡普蘭?邁耶曲線（KM）法分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組VEGF、melanA、LncRNAHOTAIR陽性表達

惡性組VEGF、LncRNA HOTAIR 陽性表達率高于良性組，melanA 陽性表達率低于良性組（P<0.05）。見表1、圖1。

圖1 良惡性腎上腺PCC 患者VEGF、melanA 表達（SP，×400）Figure 1 The expression of VEGF in patients with benign and malignant adrenal PCC was detected（SP，×400）

表1 兩組VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 陽性率比較［n（%）］Table 1 Comparison of the positive expression of VEGF，Melania and lncrna hotair between 2 groups［n（%）］

2.2 惡性組不同臨床資料患者VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 陽性表達比較

惡性組不同年齡、性別、腫瘤直徑、腫瘤體積患者VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 陽性表達率比較，差異無統計學意義（P>0.05）；惡性組不同臨床分期、分化程度、浸潤程度、有無淋巴結轉移患者VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 陽性表達率比較，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 惡性組不同臨床病理特征患者VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 陽性表達比較［n（%）］Table 2 Comparison of positive expression of VEGF，Melania and lncrna hotair in patients with different clinicopathological characteristics in malignant group［n（%）］

2.3 VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表達與惡性組臨床病理特征的相關性

經Spearman 相關性分析可知，VEGF、LncRNA HOTAIR 陽性表達與惡性組臨床分期、浸潤程度、淋巴結轉移呈正相關，與分化程度呈負相關，melanA 陽性表達與惡性組臨床分期、浸潤程度、淋巴結轉移呈負相關，與分化程度呈正相關（P<0.05）。見表3。

表3 VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表達與惡性組臨床病理特征的相關性Table 3 Correlation between expression of VEGF，Melania，lncrna hotair and clinicopathological features of malignant group

2.4 VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表達對惡性腎上腺PCC 的鑒別效能

繪制ROC 曲線，結果顯示，VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 聯合鑒別惡性腎上腺PCC 的曲線下面積（AUC）為0.919（95%CI：0.848～0.964），敏感度、特異度分別為89.86%、93.94%（P<0.05）。見圖2。

圖2 ROC 曲線Figure 2 ROC curve

2.5 VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表達與腎上腺PCC 患者1 生存率的關系

隨訪1年，惡性腎上腺PCC 患者脫落2 例。VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 陽性表達患者1年生存率低于陰性表達患者（χ2=7.655，P=0.006；χ2=5.012，P=0.025），melanA 陽性表達患者1年生存率高于陰性表達患者（χ2=4.724，P=0.030），見圖3。

圖3 VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 表達與腎上腺PCC 患者1 生存率的關系Figure 3 Relationship between VEGF，Melania，lncrna hotair expression and 1 survival rate in adrenal PCC patients

3 討論

本研究中，惡性PCC 患者VEGF 陽性表達率高于良性PCC 患者，并與患者臨床分期、浸潤程度、淋巴結轉移存在正相關性，與分化程度存在負相關性。VEGF 可提高微血管通透性，誘導血管內皮細胞異常增殖，加快新生血管形成，進而促進腫瘤細胞生長、浸潤及轉移［10］。

既往研究表明［11］，VEGF 在多種惡性腫瘤尤其是出現浸潤和轉移的惡性腫瘤中表達率超出80.0%。結合賀亮亮［12］研究考慮上述結果產生機制可能在于VEGF 通過結合腫瘤細胞表面受體，可活化下游信號通透，直接調控腫瘤干細胞形成、增殖等進程，同時，其通過血管通透性，可介導基質溶解、新血管網構建、管腔形成等腫瘤血管形成過程，從而參與惡性PCC 細胞增殖、浸潤及轉移過程。提示對存在VEGF高表達PCC 患者需警惕其存在惡性傾向可能性。

melanA 在血管周細胞瘤、多數類固醇腫瘤（包括PCC）及黑色素細胞病變中表達，呂祥瑞等［13］通過免疫組織化學法檢測可知，惡性PCC 患者melanA 表達較低，并與患者臨床分期、浸潤程度、淋巴結轉移、分化程度存在一定相關性，支持本研究觀點，可見melanA 表達變化可為PCC 性質臨床鑒別提供新的醫學思路。推測提高melanA 表達可能是阻斷PCC 惡變、浸潤、轉移的重要途徑。

另外，本研究結果還發現，本研究提出，LncRNA HOTAIR 在惡性PCC 患者中呈高表達，且與臨床分期、浸潤程度、淋巴結轉移、分化程度有關，與孫青風等［14］研究相似。LncRNA HOTAIR 是一種促癌基因，在多種惡性腫瘤中表達升高，具有早期鑒別腫瘤、術后監測腫瘤復發及作為特異藥物治療靶點的潛在價值［15］。這可能歸因于LncRNA HOTAIR不僅可調控HOXD 啟動子相關蛋白的組蛋白修飾，激活原癌基因，破壞原癌基因與抑癌基因平衡，還能靶向調控雷帕霉素靶蛋白信號通路，提高葡萄糖同型轉運蛋白?1 表達，強化癌細胞無氧糖酵解獲能能力，從而參與腫瘤細胞生長、增殖、侵襲、轉移調控。說明LncRNA HOTAIR 與惡性PCC 發生、發展存在一定關系，可能作為惡性PCC 鑒別生物標志物，為后續研究及治療提供新靶點。進一步明確證明三者聯合鑒別惡性PCC 的AUC 為0.919，優于單獨指標鑒別，提示三者聯合有助于提高惡性PCC 鑒別效能，具有一定推廣實用性。

此外，本研究通過Log?Rank 檢驗還表明，VEGF、LncRNA HOTAIR 高表達、melanA 低表達可能降低惡性PCC 患者1年生存率，這可能與VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR 異常表達可能誘導腫瘤細胞異常增殖、加劇浸潤深度、上調局部或遠處轉移風險，從而引起不良預后有關。由此可見，VEGF、LncRNA HOTAIR 表達對惡性PCC 預后亦具有一定預測價值。但本研究局限性在于納入樣本量小，未分析VEGF、melanA、LncRNA HOTAIR三者之間相關性及在PCC 中的具體作用機制，今后需進一步開展大樣本研究論證所得結果。

綜上所述，惡性PCC 患者VEGF、LncRNA HOTAIR 表達升高，melanA 表達下降，三者聯合檢測可為臨床鑒別PCC 性質、評估病理特征、預測預后提供循證支持。