2018-2019年廣州市區某院甲型流感流行病學特點和檢測方法比較

黃佳斯 何宇婷 陳瑤 余學高 黃浩 陳培松★

流行性感冒是指因流行性感冒病毒引起的急性呼吸道傳染疾病，多為自限性，但在兒童、老年及機體免疫功能低下人群，可出現病毒性肺炎等并發癥，重者可因急性呼吸窘迫綜合征（Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS）合并多臟器功能衰竭致死。根據流感病毒核蛋白和基質蛋白抗原性的差異，可分為甲、乙、丙三型。世界衛生組織（World Health Organization，WHO）發布的最新全球流感流行病學報告［1］，2018-2019年冬春季，季節性流感以甲型流感為主。鑒于甲型流感病毒臨床癥狀的非特異性，迫切需要一種準確的早期診斷方法，以期能早期應用抗病毒藥物，及時控制病情。本研究分析了12 506 例流感樣病例（influenza?like illness，ILI），探討甲型流感病毒的流行特征、流行結構和分布規律，并以Real?time RT?PCR 為參考方法，分析膠體金標記免疫層析法對甲型流感病毒的檢測性能。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年8月1日至2019年7月31日醫院門診、急診患者和住院患者中的ILI 為研究對象，ILI 的定義采取《全國流感檢測方案（2017年版）》［2］標準，即發熱（體溫≥38℃），伴咳嗽或咽痛之一者。排除標準：①非首診患者；②已服用神經氨酸酶抑制劑類抗流感藥物者；③已有明確實驗證據可以解釋發熱原因者；④不明原因發熱患者；⑤不愿或不能配合進一步檢查者。共納入12 506 例患者，其中男性6 379 例，女性6 127 例，年齡平均（27.37±23.20）歲；其中161 例使用Real?time RT?PCR 法檢測，11654 例使用膠體金標記免疫層析法檢測，691 例同時使用了Real?time RT?PCR 法和膠體金標記免疫層析法檢測。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，全部入組患者均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑

Clearview 甲型/乙型流感病毒抗原檢測試劑盒（艾博生物醫藥（杭州）公司）；核酸提取或純化試劑（中山大學達安基因股份有限公司，批號：DA0623）、全自動核酸提取儀（中山大學達安基因股份有限公司，型號：Smart32）；甲型流感病毒核酸檢測試劑盒（中山大學達安基因股份有限公司）；實時熒光定量PCR 分析儀（美國ABI 公司，型號：Prism7500）

1.3 方法

1.3.1 標本采集與處理

用兩支滅菌棉棒同時采取疑似患者鼻拭子樣本，放入無菌容器后于常溫保存，并在30 min 內送至檢驗科檢測。標本采集與運輸均按照《廣東省流感監測方案（2017年版）》［3］實施。

1.3.2 核酸提取

在上述滅菌棉棒中加入1 mL 無菌生理鹽水，震蕩混勻后取300 mL 于核酸提取試劑盒，嚴格按照說明書操作。

1.3.3 反轉錄實時（Real?time RT）PCR 檢測流感病毒

嚴格按照說明書，利用一步法Real?time RT?PCR檢測技術，以甲型流感病毒基因編碼區的高度保守區為靶區域，設計特異性引物及熒光探針，實現對樣本中流感病毒的定性檢測。

1.3.4 膠體金標記免疫層析法操作流程

向軟管內滴6 滴Flu 裂解液，將一支棉棒放入后，旋轉擠壓棉頭，拔出棉棒，將檢測試劑條放入軟管，15 min 后醫務人員根據條帶判讀結果。

1.3.5 診斷標準

診斷標準采用《流行性感冒診療方案（2018年版）》［4］確診病例標準。流感臨床癥狀加上Real?time RT?PCR 和/或膠體金標記免疫層析法檢測陽性診斷為甲型流感病例。當兩種方法結果不一致時，以Real?time RT?PCR 法檢測為參考方法。

1.4 統計分析

采用SPSS 19.0 統計軟件包進行數據描述和統計分析，計數資料以n或（%）表示，2×2 四格表總結檢測結果，并計算敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、符合率及尤登指數，一致性用Kappa 檢驗。如敏感度、特異度和符合率超過90%，則認為研究方法與參考方法結果一致；一致性Kappa 值≥0.75 表示研究方法與參考方法高度一致，Kappa≥0.40 為基本一致，Kappa<0.40 為不一致。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ILI 及甲型流感的時間分布

2018年8月到2019年7月甲型流感檢出主要集中在1月到7月，最高峰在1月，其他月份以散發為主。見表1。

表1 甲型流感檢出率月份分布［n（%）］Table 1 The t detection rates of influenza A in months［n（%）］

2.2 不同性別ILI 甲型流感檢出率

不同性別ILI 甲型流感檢出率比較，差異無統計學意義（χ2=0.606，P>0.05）。見表2。

表2 不同性別ILI 甲型流感檢出率比較［n（%）］Table 2 Comparison of detection rates of ILI influenza A between male and female patients［n（%）］

2.3 不同年齡組ILI 甲型流感檢出率

按照年齡的大小，病例共分為5 個年齡組，7～17 歲組陽性率最高，為6.19%，年齡≥66 歲組（4.54%）次之，不同年齡組間ILI甲型流感陽性率比較，差異有統計學意義（χ2=31.260，P<0.05）。見表3。

表3 不同年齡組ILI 甲型流感檢出率比較Table 3 Comparison of detection rates of ILI influenza A among different age groups

2.4 Real?time RT?PCR 和膠體金標記免疫層析法結果比較

在691 例同時使用兩種方法檢測的ILI 鼻咽拭子標本中，膠體金標記免疫層析法檢測出甲型流感病毒17 例，見表4。Real?time RT?PCR 法105份陽性標本中，膠體金標記免疫層析法陽性11例，另94 例未檢出；而586 例陰性標本中，6 例膠體金標記免疫層析法陽性。與參考方法比較，膠體金標記免疫層析法靈敏度為10.48%，特異度為98.98%，陽性預測值為64.71%，陰性預測值為86.05%，符合率85.53%，尤登指數0.095，一致性Kappa 值0.144（P<0.01）。

表4 Real?time RT?PCR 和膠體金標記免疫層析法結果Table 4 Results of Real?time RT?PCR and colloidal gold labeled immunochromatography

3 討論

甲型流感病毒經常發生抗原轉變及抗原漂移，其抗原變異直接導致人類特異性免疫失效，是引起流感世界大流行爆發的主要病原體。因此，甲型流感病毒的研究受到更多關注。該院地處廣州市區，2018年8月至2019年7月甲型流感病毒病原學監測結果顯示，甲型流感檢出主要集中在1月到7月，最高峰在1月，其他月份以散發為主。這與北方地區多為冬季流行有所不同［5］，與廣東省流感的流行特征相似［6?8］，且與我國南方地區春夏季是流感病毒主要流行季節的觀點一致［9］。由于該段時間廣州的天氣特征是溫暖多雨，多霧霾，溫差大，空氣流動性差，與國內其他省市流行特征不盡相同［10］。但本研究中甲型流感病毒的總體陽性率及峰值陽性率均低于世界衛生組織（WHO）發布的2018～2019年冬春季全球流感流行病學報告數據［1］，可能與采用的檢測方法有關。

大量研究顯示，年齡影響流感病毒的表達，但研究結果尚無統一定論。蔣小仙［11］等發現25～60歲青壯年為流感高發人群，而葛愛華［12］等則報道5～14 歲學齡兒童ILI 陽性率更高。本調查發現，7～17 歲的學齡兒童及少年陽性率最高，其次是66 歲以上老年人及3～6 歲學齡前兒童。分析原因可能是學齡前兒童、學齡兒童和青少年以集體活動為主，且自我保護意識較差，一旦有流行病毒入侵，容易造成大規模的流行；而66 歲以上老年人的陽性率僅次于7～17 歲的學齡兒童及青少年，與國內外的研究報道［13?14］不一致，這可能與該院接收的該年齡階段人群多為急重癥患者，常合并基礎疾病，免疫力低下有關。

目前用于流感病毒的檢測技術主要包括病毒分離培養法、免疫熒光技術、酶聯免疫測定法、膠體金免疫層析技術、RT?PCR 等。本研究采用臨床上常用的兩種方法（Real?time RT?PCR 法和膠體金標記免疫層析法）進行甲型流感病毒檢測，與參考方法比較，膠體金標記免疫層析法的靈敏度較差，漏檢率高達89.52%，且存在假陽性，兩種方法一致性較差。可能原因有：①流感病毒HA 和NA 核酸序列易發生變異引起病毒抗原漂移，導致抗原檢測出現假陰性結果［15］；②膠體金標記免疫層析法的靈敏度受拭子材料、患者年齡、病程、呼吸道標本種類等影響［16］；③由于采樣或實驗操作導致的污染可造成膠體金標記免疫層析法假陽性；④試劑與不同的病毒、細菌及真菌可能存在交叉反應影響導致假陽性；⑤膠體金標記免疫層析法結果判讀具有一定的主觀性。Real?time RT?PCR 檢測技術通過保守區域序列擴增來實現病毒核酸的檢測，具有靈敏度高、特異性強、自動化程度高和大大降低污染可能性等特點，優于膠體金標記免疫層析法［15］。但Real?time RT?PCR 檢測成本較高，操作人員需要特殊培訓上崗，且出于節約人力物力成本等考慮，臨床實驗室經常批量檢測，周轉時間延長，導致Real?time RT?PCR 法較難常規開展。本研究中12 506 例ILI 使用Real?time RT?PCR 法檢測的比例僅為6.81%，這也正是導致總體陽性率偏低的原因。因此，臨床上應該更加重視病原學的核酸檢測，同時不斷提高包括膠體金法在內的快速法的靈敏度和特異度，為臨床流感患者提供更加快速、準確的診斷輔助措施。