高通量測序在一罕見脊柱肋骨發育不全病例診斷中的應用

曾玉坤 丁紅珂 劉玲 余麗華 張彥★

脊椎肋骨發育不全（spondylocostal dysostosis，SCDO）是一種以脊柱/脊椎嚴重分節障礙和肋骨發育不良為表現的罕見先天性疾病，一般呈常染色體隱性遺傳，其臨床特點主要表現為椎骨和肋骨發育異常，包括椎骨節段異常、胸骨變短、肋骨排列異常，同時常伴肋骨減少，胸廓畸形等［1?3］。該疾病發病機制較復雜，通過臨床表型明確診斷及分型十分困難。本研究通過對一例超聲結構明顯異常胎兒及其父母采用高通量測序的方法進行檢測，后續針對發現的基因變異位點進行致病性預測分析，檢測結果為孕婦本人及臨床醫生進行遺傳咨詢及指導提供了科學依據。

1 研究對象與方法

1.1 病例資料

孕婦，29 歲，孕19 周，2019年8月因超聲發現胎兒脊柱發育異常來本院產前診斷中心就診。檢測結果提示：胎兒全段脊柱排列不齊，椎體大小不一，多個椎體缺失、融合，脊柱長度縮短（約56 mm）（圖1）。孕婦曾有不良孕產史：2013 足月曾剖宮產脊柱裂畸形患兒，2017年再次因超聲發現胎兒脊柱裂引產。受檢者先后進行羊水染色體核型分析及染色體微陣列基因芯片檢測（chromosomal microar?ray，CMA），均未見異常。為進一步明確病因，通過采用高通量測序的方法針對孕婦本人及丈夫以及胎兒進行醫學外顯子組序列分析。

圖1 胎兒脊柱超聲影像圖Figure 1 Ultrasound image of fetal spine

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取

使用乙二胺四乙酸二鉀抗凝管抽取孕婦本人及丈夫外周血各3 mL。采用血液基因組DNA 提取試劑盒（廈門致善生物科技股份有限公司），培養過的羊水樣本采用Qiagen DNA MINI Kit 50 試劑盒進行DNA 提取，提取的全基因組DNA 均使用nanodrop2000（Thermo，美國）檢測，外周血DNA大于80 ng/μL，羊水DNA 大于100 ng/μL，A260/A280 在（1.8～2.0）之間，于-20℃中保存備用。

1.2.2 羊水樣本母體污染鑒定

采用熒光PCR?毛細管電泳法同時檢測胎兒和母親13 個微衛星多態標記位點，防止因母源污染而引起誤診。

1.2.3 醫學外顯子組序列分析

將提取的孕婦及丈夫外周血全基因組DNA 及羊水DNA 各100 μL，送至廣州嘉檢醫學檢測有限公司進行與人類疾病相關的4 000 個已知基因編碼外顯子區域及側翼區的序列分析。測序后獲得的原始數據通過使用BWA 軟件進行序列比對，采用GATK和Var Scan 軟件對變異進行識別，包括單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）、插入與缺失等進行檢測、注釋和統計分析。利用Annovar軟件從外部數據庫進行變異位點注釋，以評估給定的序列變異的影響。根據數據分析結果，參考db SNP 數據庫和HGMD 數據庫找出可能的致病突變。

1.2.4 Sanger 測序驗證

根據經醫學外顯子組高通量測序后分析結果，使用Sanger 測序方法對胎兒及父母變異位點進行驗證。采用Primer5 軟件設計引物，用聚合酶鏈反應（PCR）技術擴增HES7基因（NM_001165967）變異位點c.674T>C（p.F225S）相應外顯子及其側翼序列，引物由天一輝遠廣州基因科技有限公司合成，引物序列為：HES7?EX4F：CTTGG?TATCTCTGCGCCC，HES7?EX4R：CCTCGGGCT?GGAGTCTCTAC。按以下條件進行進行PCR 擴增：LATaq 預混液12.5 μL，甜菜堿5 μL，正、反向引物各1 μL，樣本DNA 1 μL，無核酸水至25 μL；PCR 反應條件為94℃預變性5 min；94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸40 s，進行40 個循環；最后72℃延伸10 min。PCR 產物送至天一輝遠廣州基因科技有限公司進行Sanger 測序。

1.2.5 變異位點致病性分析

1.2.5.1 突變部分氨基酸物種間保守性分析 通過數據庫查找具有代表性的不同物種間該位點氨基酸保守性分析，以期揭示突變區域是否高度保守。

1.2.5.2 蛋白質一級結構比對分析 通過TheEx?PASY 軟件的Protparam 工具（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）對正常蛋白和突變蛋白計算主要理化性質。

1.2.5.3 蛋白二級結構比對分析 應用TheEx?PASY（http：//www.expasy.ch/）和蛋白質二級結構預測軟件predictprotein（https：//www.predictprotein.org/）對蛋白二級結構進行預測和比對，分析鑒別正常與突變蛋白在變異位點附近是否會造成二級結構的改變，進而推斷變異是否存在致病性。

1.2.5.4 蛋白三級結構對比分析 應用SWISS?MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）對正常蛋白和突變蛋白三級結構進行預測和比對，初步推斷突變對HES7蛋白三級結構的影響情況，進一步推測變異是否存在致病性。

1.2.5.5 PolyPhen?2 軟件預測變異是否存在致病性通過登錄軟件polyphen?2 在線網址（http：//genetics.bwh.harvard.edu/pph2/），按照要求輸入相關信息，對變異位點進行致病性預測分析。

2 結果

2.1 醫學外顯子組測序結果

2.1.1 高通量測序數據質控參數

基因包檢測區間覆蓋有人類基因組中致病機制明確的4 000 個相關基因，74 566 個編碼區總共含有12 424 088 個堿基。平均覆蓋深度256+/-180X，大于10X 覆蓋區間占97.4%，大于20X 覆蓋區間占94.4%，參考序列版本號：GRCh37/hg19。

2.1.2 相關基因醫學外顯子檢測突變結果

通過數據分析后發現先證者HES7基因存在（NM_001165967）c.674T>C（p.F225S）位點純合變異。

2.2 Sanger測序驗證

對PCR 產物進行Sanger 測序，發現先證者HES7基因c.674T>C（p.F225S）純合變異，父母分別為該位點變異攜帶者，與高通量測序結果一致。見圖2。

圖2 HES7 基因c.674T>C（p.F225S）位點sanger 測序圖Figure 2 Sanger sequencing of c.674T>C（p.f225s）ofHES7 gene

2.3 變異位點的致病性分析

2.3.1 突變部分氨基酸物種間保守性分析

通過查找數據庫，分析HES7基因第225 位氨基酸在已知的不同物種間的保守性。見圖3。

圖3 HES7 基因c.674T>C（p.F225S）在不同物種間保守性分析Figure 3 HES7 gene c.674T>c（p.f225s）conservative analysis in different species

2.3.2 蛋白一級結構比對分析

通過TheExPASY 軟件的Protparam 工具計算分析正常蛋白和突變蛋白主要理化性質。見表1。

表1 野生型及突變型理化性質對比Table 1 physical and chemical properties between wild type and mutant type

2.3.3 蛋白二級結構及三級結構比對分析 比對發現B 蛋白的α 螺旋與β 片層結構域發生了變化；C 表示野生型蛋白的三級結構，D 表示突變型蛋白的三級結構，分析后發現C 與D 結構也發生了部分空間結構變化（箭頭所指位置）。見圖4。

圖4 野生型與突變型蛋白質的二級結構與三級結構比對圖Figure 4 Comparison of secondary and tertiary structures of wild?type and mutant?type proteins

2.3.4 PolyPhen?2 軟件初步預測結果

將蛋白質ID 號與突變氨基酸位置及突變前后的氨基酸簡寫輸入相應位置，初步預測分值為0.957。見圖5。

圖5 PolyPhen?2 預測HES7 基因c.674T>C（p.F225S）位點變異致病可能性Figure 5 Polyphen?2 predicted the pathogenicity of HES7 gene c.674T>C（p.f225s）

3 討論

SCDO 是一種罕見的先天性軸向骨骼發育異常，其在胚胎發育過程中因體節（椎骨，肋骨及相關肌腱和肌肉的前體組織）破裂而形成，脊椎肋骨發育不全可分為五型，相關類型及致病基因分別為：DLL3（SCDO1：MIM277300），MESP2（SCDO2：MIM 608681），LFNG（SCDO3：MIM609813），HES7（SCDO4：MIM613686）和TBX6（SCDO5：MIM122600）［4?10］。研究發現這些基因均為Notch 信號通路的重要組成部分，而Notch 信號通路通過調節成骨和破骨細胞譜系細胞的分化和功能，進而對軟骨形成、骨形成和破骨過程產生重要的調控作用，因而該信號通路的失控將導致骨骼發育異常［11?13］。目前國內外與SCDO 相關致病變異報道較為少見，亦無明確的SCDO 發病率數據。本研究中的人類HES7基因位于17p13.1，共有4 個外顯子，是Notch 信號傳導的直接靶基因，通過信號通路調控體節形成從而參與調控脊椎的正常發育。相關文獻報道HES7基因還通過調控LFNG（Notch 信號通路核心基因）等多個效應基因構成復雜的分節時鐘，精密地調控體節的分節過程［14］。Sparrow 等學者［9］研究發現HES7基因上的致病突變會導致神經管缺陷，Bessho 等［15］研究發現在敲除HES7基因的小鼠中因為體節分節不能完全正常進行，最終會導致肋骨和脊椎的嚴重畸形。

本研究中常規超聲檢查發現胎兒存在脊柱異常，孕婦本人又曾多次孕育脊柱異常胎兒，這些均在較大程度上提示該異常可能為某種遺傳因素所導致的遺傳性疾病，但常規羊水染色體及CMA 檢測結果均未發現異常。為進一步探尋可能存在的致病原因，后續采用高通量測序的方法針對胎兒、孕婦及孕婦丈夫進行家系分析，最終在HES7基因上發現了一個與胎兒超聲表型密切相關的變異位點。通過分析突變位點所在氨基酸在已知不同物種間高度保守性情況，突變前后蛋白的主要理化性質，二級結構與三級結構，結合相關軟件預測結果，綜合判斷分析后認為該位點為致病變異位點的可能性大，與胎兒的異常表型關系較密切。

由于導致脊柱肋骨發育不全的因素十分復雜，目前國內外與HES7基因導致的SCD04 相關研究報道也較少見，因而針對散發、罕見的遺傳疾病的診斷，如果僅憑借影像學及臨床醫生的經驗進行診斷，明確致病因素無疑存在較大困難和漏診風險。高通量測序的發展以及其在檢測基因變異中表現出較高的靈敏度，使得這種技術在臨床檢測尤其是罕見單基因遺傳疾病的診斷中應用越來越普遍。隨著技術的進一步發展及檢測成本的不斷下降，高通量測序技術為今后進一步高效準確尋找到罕見遺傳病的相關致病基因，為臨床醫生更快更有效地進行疾病診斷及后續遺傳咨詢提供了科學依據。本研究雖然在一定程度上發現了可能的致病基因及位點，但針對于位點的分析均基于生物信息學預測所得，進一步的蛋白表達及功能實驗將更有利于進一步闡明變異位點與疾病的關系，這也是本研究下一步需要研究的內容。