高通量測序法微衛星不穩定性檢測評價

賈錚 徐任 張文新 黃杰★ 曲守方★

微衛星（Microsatellite）是指人類基因組中的短串聯重復序列，有單核苷酸、雙核苷酸或高位核苷酸的重復。微衛星不穩定性是細胞內的微衛星由于重復單位的插入或缺失而導致微衛星長度的改變，包括微衛星高度不穩定（Microsatellite insta?bility?high，MSI?H）、微衛星低度不穩定（Microsat?ellite instability ?low，MSI?L）及微衛星穩定（micro?satellite stability，MSS）等狀態，是由錯配修復（Mismatch repair，MMR）基因MSH2、MSH6、MLH1、PMS1和PMS2發生缺陷引起的，與腫瘤的發生密切相關［1?2］。臨床上已將MSI 作為結直腸癌及其他實體瘤預后和制定輔助治療方案的重要分子標志物，并用于林奇綜合癥（Lynch syndrome）篩查［3?4］。美國食品藥品監督管理局（FDA）批準PD?L1 抑制劑帕博利珠單抗注射液（Keytruda 或Pembrolizum?ab），用于治療微衛星高度不穩定（MSI?H）或錯配修復基因缺陷（deficient mismatch repair，dMMR）的實體瘤患者［5］，這是首款依照分子標記物進行區分的抗腫瘤療法。

目前臨床檢測MSI，主要是使用免疫組織化學方法檢測腫瘤組織中錯配修復基因MLH1、MSH2、MSH6及PMS2的表達［6?7］，和國際公認的金標準?多重熒光PCR 結合毛細管電泳方法檢測特異的微衛星重復序列擴增判定MSI 狀態［8?9］。隨著高通量測序技術（High throughput sequencing）發展，該技術已經成為MSI 檢測的新發展方向［10?12］。國內已經有多家公司開發基于高通量測序平臺的MSI 檢測試劑盒。本研究使用微衛星不穩定性檢測國家參考品作為統一的標準，評價MSI 檢測試劑盒（高通量測序法）的性能。

1 材料與方法

1.1 參考品

MSI 檢測國家參考品，批號：360028?201901，中國食品藥品檢定研究院提供。

1.2 試劑與儀器

人類多基因突變聯合檢測試劑盒（可逆末端終止測序法），購自江蘇先聲醫療器械有限公司。Genom?ic DNA Reagents、D1000 Reagents 和D1000 Screen?Tape，購自美國Agilent Technologies 公司。NextSeq 500/550 High Output Reagent Cartridge v2（300 cy?cles）、NextSeq 500/550 Buffer Cartridge v2、NextSeq Accessory Box v2、NextSeq 500/550 High Output Flow Cell Cartridge v2.5購自美國illumina公司。

ME220 超聲打斷儀，購自美國Covaris 公司。4 200 TapeStation 片段分析系統，購自美國Agilent Technologies 公司。NextSeq550Dx 基因測序儀，購自美國illumina 公司。

1.3 方法

1.3.1 文庫構建

取不少于100 ng 國家參考品DNA，轉移到Covaris 超聲打斷管中，設置超聲打斷儀各參數后進行DNA 片段化處理。然后將片段化DNA 進行末端修復和接頭連接，然后進行PCR 擴增，制備文庫。

1.3.2 雜交捕獲

采用試劑盒具有特定DNA 序列的捕獲探針與文庫進行雜交，從而特異性捕獲目標區域，通過磁珠法富集被探針捕獲的目標區域DNA 片段。將捕獲文庫進行PCR 擴增。純化后的文庫使用Agilent 4200 TapeStation 進行檢測，要求主要片段的峰值為220 bp～350 bp 左右，無明顯小片段和大片段雜峰，主要片段的濃度應>3 ng/μL。然后獲得合格的文庫。

1.3.3 上機測序

將已定量合格的文庫加入到試劑盒的標準化文庫試劑和磁珠懸浮緩沖液，經過洗脫緩沖液的洗脫，獲得標準化文庫。標準化文庫加入到NextSeq 500/550 High Output Reagent Cartridge v2（300 cy?cles）中，配合NextSeq 500/550 Buffer Cartridge v2、NextSeq Accessory Box v2、NextSeq 500/550 High Output Flow Cell Cartridge v2.5，使用NextSeq550Dx基因測序儀進行測序。使用“人類多基因突變聯合檢測試劑盒分析軟件”對下機數據進行分析，獲得樣本的MSI 結果。

1.4 結果判定

根據陰性樣本構建的MSI 基線（Baseline），從下機數據的bam 文件中分析樣本的微衛星不穩定狀態。對每個樣本給出微衛星不穩定的位點數目（如果位點的Distance>0.08 且P<0.01，則該位點是MSI 不穩定位點）和可用的MSI 位點數，計算MSI值，其公式為：MSI 值=MSI 不穩定位點數/可用的MSI 位點數×100%。當樣本的MSI 值大于等于15%時結果為MSI?H，MSI 值小于15%時結果為MSS。

1.5 統計學分析

使用python 3.7 中math、np 和scipy 包進行數據統計分析，計算待測樣本與MSI 基線樣本間以及MSI 基線樣本間的Jensen?Shannon（JS）距離（Dis?tance），2 組Distance 數據間比較采用單邊t檢驗進行分析（P），以P<0.01 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 陽性參考品結果

國家參考品中的16 對陽性參考品共32 例樣本檢測結果顯示均為微衛星高度不穩定，見表1。以國家陽性參考品MSI?3 及其配對參考品MSI?3?對照（MSI?3?DZ）的chr2：16083525 位點的結果為例，見圖1。在MSI?3?DZ 和基線樣本中堿基重復數（Repeat?Length）集中分布在15 個串聯重復T上，在MSI?3 中12 個串聯重復T 上也有一個較高的峰值，表明該位點發生了微衛星不穩定，計算該位點的重復單元長度與基線樣本的Distance 為0.2083 且P為0.0000（Distance>0.08 且P<0.01），結果為該位點是微衛星不穩定位點。MSI?3?DZ 的該位點的Distance 為0.0551 且P為0.0004，結果為該位點是微衛星穩定位點。軟件分析國家陽性參考品MSI?3 的MSI 值為72.38%（76/105），結果為MSI?H；MSI?3?DZ 的MSI 值為1.87%（2/107），結果為MSS。

表1 MSI 國家參考品的結果Table 1 The results of national reference MSI

圖1 國家陽性參考品MSI?3 及其配對參考品MSI?3?對照的結果（chr2：16083525）Figure 1 The results of national positive reference MSI?3 and its matched reference MSI?3?control（chr2：16083525）

2.2 陰性參考品結果

國家參考品中的3 對陰性參考品共6 例樣本檢測結果顯示均為微衛星穩定，見表1。以國家陰性參考品MSI?19 及其配對參考品MSI?19?對照（MSI?19?DZ）的chr2：16083525 位點的結果為例，見圖2。MSI?19 和MSI?19?DZ 與基線樣本的分布情況相近，堿基重復數均集中分布在15 個串聯重復T 上，計算該位點的Distance 和P，結果為該位點是微衛星穩定位點。軟件分析國家陰性參考品MSI?19 的MSI 值為9.73%，MSI?19?DZ 的MSI 值為8.00%，結果均為MSS。

圖2 國家陰性參考品MSI?19 及其配對參考品MSI?19?對照的結果（chr2：16083525）Figure 2 The results of national negative reference MSI?19 and its matched reference MSI?19?control（chr2：16083525）

2.3 檢測限參考品結果

國家參考品中的6 組檢測限參考品共24 例樣本檢測結果顯示，對20%和10%腫瘤DNA 含量的檢測限參考品均能正確檢出相應的微衛星不穩定性狀態，而對5%腫瘤DNA 含量的微衛星高度不穩定性狀態的LOD1 及LOD3 檢測限參考品未能正確檢出相應的微衛星不穩定性狀態，見表1。以國家檢測限參考品MSI?LOD3?20%、MSI?LOD3?10%、MSI?LOD3?5%及其配對參考品MSI?LOD3?對照（MSI?LOD3?DZ）的chr22：29682881 位點的結果為例，見圖3。MSI?LOD3?5%和MSI?LOD3?DZ 的MSI 值分別為9.09%和1.06%，結果為MSS。

3 討論

與傳統PCR 方法相比，高通量測序技術具有通量高、靈敏度強和特異性強等特點，可以實現對樣本中多個微衛星位點和多個疾病相關基因同時檢測，能夠輔助腫瘤診斷、預后評估或選擇治療方案。2017年11月16日，美國FDA 批準紀念斯隆·凱特琳癌癥研究中心（Memorial Sloan Kettering Cancer Center，簡稱MSK）基于高通量測序技術的癌癥基因檢測分析平臺MSK?IMPACTTM，能夠一次對病人腫瘤468個基因的突變進行檢測，并且可以檢測MSI基因組特征，但僅限于在MSK 中進行使用，其檢測結果不與任何藥物聯用［13］。2017年11月30日，美國FDA 批準了Foundation Medicine 公司針對多種實體瘤的二代測序的體外檢測產品—FoundationOne CDx（F1CDx），僅允許在Foundation Medicine 公司進行檢測。該產品可以檢測5 種腫瘤中的324 個基因的突變，也可以檢測MSI和腫瘤突變負荷（TMB）兩個基因組特征，是FDA 批準的首款獲得突破性認定的癌癥高通量測序體外診斷檢測產品［14?15］。國內已有多個公司在基于高通量測序平臺的腫瘤大Panel 檢測中加入MSI 檢測流程，進行試劑盒的開發和應用。國家藥品監督管理局（NMPA）在2021年1月批準常州桐樹生物科技有限公司的微衛星不穩定（MSI）檢測試劑盒（多重熒光PCR?毛細管電泳法），可以體外定性檢測結直腸癌患者腫瘤組織FFPE 樣本的“2B3D”（BAT?25、BAT?26、D5S346、D2S123、D17S250）微衛星位點狀態，但是尚未批準基于高通量測序法的MSI檢測試劑盒。

為了更好評價上市前的微衛星不穩定性檢測試劑盒（高通量測序法）的性能，建立標準化的國家參考品是非常有必要的。本院建立的微衛星不穩定性檢測國家參考品，是腫瘤組織或者細胞系和相應的配對樣本，包括MSI?H、MSI?L 及MSS 三種狀態，其中微衛星高度不穩定的陽性參考品涵蓋了不同的微衛星不穩定位點，檢測限參考品設置20%、10%、5%三種不同腫瘤DNA 含量［16］。MSI 國家參考品采用國際公認的MSI 金標準方法：多重熒光PCR?毛細管電泳法進行標定，給出相應的MSI 狀態，要求高通量測序法的結果與金標準方法的結果進行比對，因此也適用于高通量測序法。對國家參考品62 例樣本的結果顯示，陽性參考品的結果均為微衛星高度不穩定，陰性參考品的結果均為微衛星穩定，20%和10%腫瘤DNA 含量檢測限參考品的結果均符合相應的標示結果，而對5%腫瘤DNA含量的微衛星高度不穩定狀態的檢測限參考品LOD1 及LOD3 未能檢出正確結果。在臨床應用中MSI 檢測限一般規定為20%腫瘤DNA 含量，國家參考品要求試劑盒對20%和10%腫瘤DNA 含量的檢測限參考品必須檢出相應的微衛星不穩定性狀態；對5%腫瘤DNA 含量的檢測限參考品不作要求。建立的MSI 國家參考品，能夠適用于MSI 檢測試劑盒（高通量測序法）的性能評價。