高效液相色譜-串聯質譜法測定不同產地三葉青主要化學成分

孫崇魯，俞松林，楊穎欣，陳宏降，張煜炯

(浙江醫藥高等專科學校，浙江 寧波 315100)

三葉青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)為葡萄科崖爬藤屬植物，學名三葉崖爬藤，又名角烏蘞莓、石老鼠、金錢吊葫蘆等，是中國特有珍稀植物，主要分布于我國安徽、云南、福建、浙江、江西、湖南等地，2018年入選新“浙八味”中藥材培育品種，具有清熱解毒、消腫散結等作用，民間常用于小兒高熱驚厥、咽痛、肝炎、痛瘡、毒蛇咬傷、風濕性關節炎及病毒性腦膜炎等多種疾病的治療[1]。現代藥理實驗研究發現三葉青塊根提取物具有抗腫瘤[2]、抗病毒[3]、抗炎[4]、保肝護肝[5]、免疫調節[6]等作用。同時三葉青也是多種中成藥(如華佗風痛寶、結石康膠囊、金絲地甲膠囊、金芪片等)以及保健品的主要原料。近年來三葉青野生資源因過度開發而瀕臨滅絕，被列入“浙江省首批種質資源保護名錄”[7]。

目前藥材市場上三葉青主要來源于人工栽培，主產于浙江、福建、云南、貴州等地，受氣候、土壤等條件的影響，不同產地三葉青藥材形態、質量差異較大。質量優劣評價標準的缺乏已經嚴重制約了三葉青藥材產業的發展。高效液相色譜-串聯質譜技術是一種新型的藥物成分分析方法，根據化合物分子量的不同，采用多重離子對監測(MRM)技術進行快速分析，具有抗干擾強、靈敏度高的特點[8]。近年來該技術在分析化學領域尤其在中藥研究領域得到日益廣泛的應用。本實驗采用高效液相色譜-串聯質譜技術對不同產地三葉青的10種主要成分進行同時定量研究，為三葉青的質量控制提供了科學依據。

1 儀器與試劑

QTRAP 4500 串聯四極桿質譜系統(AB Sciex公司)；LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津公司)；KQ-800KDB型高功率數控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；Secura225D-1CN電子分析天平(德國賽多利斯公司)；Sorvall ST16R型高速冷凍離心機(德國Thermo公司)；DHG-9070A型電熱鼓風干燥箱(寧波江南儀器廠)；甲醇、乙腈(德國Merck公司)，色譜純；甲酸(美國Fisher公司)，色譜純。

山柰酚-3-O-蕓香糖苷(批號Y15N8H48277)、紫英云苷(批號Y15S9H70466)、原花青素B1(批號P11N8L48152)、蘆丁(批號Y16M9S61523)、表兒茶素(批號K19J9R66088)、山柰酚(批號C26J8Y38642)、白藜蘆醇(批號R13M8S 36114)、虎杖苷(批號T31O7F23950)等對照品購自上海源葉生物科技有限公司。槲皮苷、異槲皮苷由本實驗室從三葉青中分離制備，1H、13C NMR和MS 數據經文獻[9-12]進行比較確認；純度經 HPLC-DAD (面積歸一法)檢測含量均大于98.0%。

三葉青采自浙江省、貴州省、云南省等13個不同產地，每個采樣點采集2份樣品，見表1。原植物經浙江醫藥高等專科學校彭昕教授鑒定為三葉青。所得藥材均置于烘箱中，40 ℃烘干72 h，隨后粉碎成細粉備用。

表1 不同產地三葉青地上部分樣品信息

2 方法與結果

2.1 樣品的制備

精密稱定樣品粉末0.300 0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入70%甲醇50 mL，精密稱定，于超聲波細胞破碎儀中超聲處理(功率：600 W)60min，取出，放冷，再次稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，將萃取液離心15 min，取上清液用0.22 μm 疏水PTFE濾頭進行過濾，即得供試品溶液。

2.2 對照品溶液的制備

取各對照品約10.0 mg，精密稱定，分別置于10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，搖勻，得各對照品貯備液。分別精密量取各對照品貯備液0.5 mL于10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，制備成質量濃度各為50 μg/mL的混合對照品溶液，以0.22 μm 微孔濾膜濾過，于冰箱中保存，備用。

2.3 色譜-質譜條件

液相色譜條件：色譜柱為飛諾美Kinete XB-C18(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)；流動相為乙腈溶液(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脫，0～1 min，10%A；1～5 min，10%～40%A；5～10 min，40%～60%A；10～11 min，60%～80%A；11～12 min，10%A；體積流速：0.6 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：1 μL。

質譜條件：電噴霧電離離子源(ESI)，噴霧電壓為4.5 kV；霧化溫度為450 ℃；氣簾氣為35psi；輔助氣為40 psi；質譜掃描采用MRM掃描模式；去簇電壓(Declustering Potential，DP)參數和碰撞電壓(Collision Energy，CE)質譜參數優化通過蠕動針泵注射的方法調諧各標準化合物。所得參數，見表2。

表2 質譜參數信息

2.4 標準曲線的制備

精密量取混合對照品儲備液(50 μg/mL)適量，用甲醇稀釋，得系列標準溶液濃度，依次為20.0、50.0、100.0、500、1 000 μg/L，以0.22 μm微孔濾膜濾過，在“2.3”項色譜質譜條件下進樣分析，以對照品的質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)，建立線性回歸方程、相關系數和線性范圍，結果見表3。其中混合對照品溶液(100 μg/L)的總離子流，見圖1。

表 3 回歸方程、相關系數、檢出限及定量限

注：1-原花青素B1；2-表兒茶素；3-蘆丁；4-異槲皮苷；5-虎杖苷；6-山柰酚-3-O-蕓香糖苷；7-紫英云苷；8-槲皮苷；9-白藜蘆醇；10-山柰酚。

2.5 方法學考察

2.5.1 檢出限和定量限的測定 根據 10種對照品S/N=3時的溶液濃度，計算出檢出濃度；根據S/N=10時的對照品溶液濃度，計算出定量濃度。見表3。

2.5.2 精密度實驗 分別量取不同濃度的混合對照品溶液(20、100.0、1 000 μg/L)連續測定6次，測得各目標化合物峰面積的RSD范圍為1.47%～3.67%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復性實驗 取同一批三葉青樣品粉末6份，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，依法測定，計算10種化合物的含量，其RSD范圍為 1.96%～4.83%，表明該方法重復性良好。

2.5.4 穩定性實驗 取同一供試品溶液，分別在配制后 0、2、4、6、12、24 h依法測定。根據各化合物的峰面積計算RSD值范圍為1.18%～3.77%，說明樣品溶液在24 h內穩定。

2.5.5 回收率實驗 精密稱取同一批次已知含量的三葉青樣品6份，約0.3 g，精密加入三個不同濃度的 10 種對照品溶液(20、100.0、1 000 μg/L)，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，根據標準曲線測定含量，計算各個化合物回收率范圍在97.68%～104.26%，其RSD范圍為1.66%～3.83%，表明所用方法回收率良好。

2.6 樣品含量測定

精密稱量不同產地的三葉青粉末，按“2.1”項制備供試品溶液，依“2.3”項的 UPLC-MS/MS 條件測定，不同產地的三葉青各化合物的含量，見表3。

3 討論

本研究采集了13個三葉青產區的藥材樣品，采用UPLC-MS/MS 技術同時測定了山柰酚-3-O-蕓香糖苷、紫英云苷、槲皮苷、異槲皮苷、原花青素B1、蘆丁、表兒茶素、山柰酚、白藜蘆醇、虎杖苷10個指標化學成分的含量。結果表明，本研究所用方法操作簡便，精密度、穩定性、重復性好，可用于三葉青藥材中10種成分含量的同時測定，研究可為評價三葉青藥材的質量提供一種切實可行的參考根據。

本研究測定了13批三葉青的含量，結果表明不同產地三葉青中10種主要成分含量差異很大，同一省份不同城市的藥材也有較大差異，甚至有些批次中未檢測出某些化合物，這可能與不同種植基地的三葉青引種來源不同以及生態環境的差異性有關。從收集的13批次的平均值來看，三葉青塊根中有效成分含量從高到低依次為山柰酚-3-O-蕓香糖苷、蘆丁 、異槲皮苷 、紫云英苷，原花青素 B1、虎杖苷、槲皮苷、山柰酚、白藜蘆醇、表兒茶素。