基于分子印跡技術的中藥成分綠色分離研究進展

劉顯銀，邱模昌

(江西醫學高等專科學校，江西 上饒 334000)

中醫藥在全世界傳統醫學領域有著最完整和標準化的理論體系，迄今為止，中醫藥的療效已被全世界廣泛認可[1]。中藥由許多復雜的成分組成，包括有效成分、無效成分和有毒成分，中藥有效成分的高效提取分離成為改善中藥內在質量和臨床療效的關鍵。傳統溶劑分離會帶來一定的安全和環境壓力，因此，開發一種基于環保和高效的中藥活性成分綠色分離新方法越來越迫切[2]。目前，針對中藥成分分離，除傳統的大孔樹脂吸附技術外，超臨界流體萃取、高速逆流色譜、膜分離、泡沫分離等技術的應用也越來越廣泛。1931年，Polyakov制備了具有特異性吸附能力的硅膠，并首次提出“分子印跡”的概念，其通過預先設計的具有功能基團的聚合物，特異性識別目標分子[3-4]。目前，已開發出的MIPs廣泛用于對映體分離[5-7]、分析化學[8-10]、電化學和仿生傳感器[11-13]、藥物傳遞[14-15]、生物技術[16]、食品安全[17-18]及環境科學[19-20]等領域。在中醫藥傳統理論與現代研究領域，分子印跡理論與技術還被用于探討中藥質量標志物研究[21]、中藥“十八反”配伍禁忌[22]、中藥炮制共性技術[23]、金(山)銀花紛爭[24]等重大中醫藥理論。分子印跡技術最大的優勢在于特異性結合，與中藥成分分離理論有著明顯的技術共性，近年來，將MIPs用于中藥成分分離取得了顯著的成效。本文綜述了MIPs近年來的技術進展，并對其在中藥成分綠色分離中的應用進行了探討和展望，以期為該技術在中藥領域的應用提供參考。

1 分子印跡技術概述

1.1 技術原理

在制備MIPs的過程中，模板分子首先與功能單體依靠官能團之間的聚合力形成主客體復合物。然后通過交聯劑交聯聚合或者引發劑引發單體聚合，形成高交聯的剛性聚合物，最后將模板分子洗脫或解離得到MIPs。MIPs有模板分子空間結構和相應的結合位點，對模板分子具有特異選擇性[25]。MIPs設計理念最初來源于生物學的受體-配體結合理論，由于其類似“鎖匙”的仿生學設計，因此，MIPs最大的特征為識別專一性。根據結合形式的不同，形成MIPs的聚合力可分為共價鍵、非共價鍵、半共價鍵、離子間作用力和金屬配位等類別[26]。不同類別聚合力在親和力、選擇性、吸附動力學及重現性方面有一定差異。MIPs形成原理如圖1所示。

圖1 分子印跡技術原理

1.2 常用材料

在MIPs的制備中，模板分子和功能單體往往具有特異性，根據目標產物的不同而選擇不同的模板分子和功能單體。交聯劑和引發劑的選擇則需要根據模板分子、功能單體以及反應體系的溫度、酸堿性及水相/有機相組成進行適當的篩選。交聯劑是MIPs制備中關鍵的材料，適宜的交聯劑可以保持聚合物的機械穩定性以維持特異的分子識別能力，同時對MIPs顆粒的粒徑、表面均勻性具有一定的影響，通常采用高交聯度的材料作為交聯劑。偶氮二異丁腈(AIBN)是分子印跡聚合物中最常用的自由基引發劑，作為油溶性的偶氮引發劑，可溶于大部分反應體系引發自由基的鏈反應，反應穩定，副反應少[27]。常用的交聯劑和引發劑見表1。

表1 分子印跡聚合物常用交聯劑和引發劑

1.3 制備方法

根據制備MIPs的材料性質和模板分子結構特征的不同，MIPs的制備方法可以有多種選擇。從直觀上根據模板分子在聚合物基質中嵌入方式的差異，可將制備方法分為三維分子印跡(3D)和二維分子印跡(2D)或表面印跡。根據MIPs形成過程所經歷的中間狀態不同，三維分子印跡又可細分為本體聚合法、懸浮聚合法、乳液聚合法、沉淀聚合法、溶膠-凝膠法。表面印跡根據模板分子和聚合物材料發生聚合的位置不同，又可以分為自上而下(top-down)和自下而上(bottom-up)兩種制備方法[28]。根據載體形成聚合物空腔過程的差異，表面印跡的制備方法又可以分為犧牲載體法、聚合加膜法和化學接枝法[29]。

隨著化學工業和材料科學的發展，分子印跡技術與新技術、新材料的不斷結合，MIPs的制備理論和實踐也得到了進一步的優化和提升。硼親和策略與分子印跡技術中相結合，通過pH值調控可逆共價結合，實現硼酸鹽與順式二醇物質的結合、解離，有利于模板分子的印跡與去除[30-31]。離子液體是指由有機陽離子和無機或有機陰離子組成，在室溫或者接近室溫狀態下完全呈液態的物質。離子液體可以作為溶劑、致孔劑、模板、功能單體等參與MIPs的制備，提高體系的溶解性及功能單體與模板分子間的結合能力[32]。采用溫敏型材料制備的溫敏型MIPs[33]以及采用pH值敏感材料制備pH敏感型MIPs也成為當前的研究熱點[34]。常見的MIPs制備方法的工藝流程及優缺點見表2。

表2 常用的MIPs制備方法的工藝流程及優缺點

2 在中藥成分分離中的應用

中藥化學成分復雜，各成分化學結構及性質差異較大，以化學成分為物質基礎的中藥藥理藥性研究是中醫藥現代化系統工程的重點內容。與其他分離技術相比，無論是對于單一成分還是對一類結構類似物的有效部位的分離，分子印跡技術都顯示出獨特的優勢，各種分離技術對比見表3。近年來，分子印跡技術還被用于中藥有毒成分的分離而發揮減毒增效的作用。基于藥效功能基團研究的不斷發展，分子印跡技術還可用于新的活性成分篩選。

表3 不同中藥分離技術對比

2.1 有效成分的分離

中藥有效成分的富集為藥物的結構鑒定、活性篩選、制劑制備等提供基礎，對目標分子的特異性吸附能力是MIPs最重要的指標。Yu等[58]將質量比為1∶4的紅景天苷和丙烯酰胺溶于7mL二甲基甲酰胺溶液中超聲30 min，加入一定量的EGDMA和AIBN，室溫下氮氣保護攪拌30min后迅速升溫至60 ℃，持續反應24 h得到聚合物。聚合物用甲醇-乙酸回流(9∶1，V/V)索氏提取，除去紅景天苷模板分子。對MIPs性能研究表明，隨著紅景天苷的濃度從3 mg·L-1增加到100 mg·L-1，MIPs對紅景天苷的吸附能力由180μg·L-1提高到1 260μg·L-1。除了吸附能力，MIPs的穩定性至關重要。Bi等[59]將籠型聚倍半硅氧烷(POSS)加入到聚合體系中，無機POSS分子在MIPs中起骨架支撐作用，增大MIPs的比表面積和孔隙率，從而增加其吸附能力，同時增大MIPs結構的穩定性。為了使MIPs具有快速的吸收動力學，高選擇性和更高結合能力，在制備過程中引入磁性物質制備的磁性MIPs取得了很好的效果。外加磁場使MIPs與體系發生快速分離，最大程度保護了MIPs結構完整性，同時由于其粒徑較小，具有較大比表面積，因此具有較高的吸附容量[60]。除了針對單一成分具有較好的識別和分離能力，MIPs同樣可以用于分離中藥的一類或幾類化學成分即有效部位。有效部位往往具有相同或者相近的理化性質，反映其結構上有特征性的相似基團，即可為模板分子的選擇提供依據，制備相應的MIPs。MIPs對目標成分分離效率主要采用最大吸附容量、方法回收率、印跡因子、分離因子及提取物純度等指標進行描述。近5年MIPs用于中藥有效成分分離統計見表4。

表4 近5年(2015-2020)MIPs用于中藥有效成分分離統計

2.2 有效成分的篩選

中藥有效成分或有效成分群藥理作用篩選是闡明中藥藥效物質基礎的關鍵性工作。分子印跡技術運用于活性成分篩選有多種形式，目前有一些探索性研究。Xie等[96]運用“敲除”理念，采用毛蕊異黃酮作為模板分子，制備了能特異性識別黃芪中黃酮類化合物的MIPs，與固相萃取技術結合，特異性“敲除”黃芪中黃酮類成分，獲得黃芪提取物組、黃酮“敲除”組、黃酮組，對比三者的心肌細胞保護作用。結果表明在細胞毒性實驗、活性氧實驗和線粒體膜通透性實驗中，黃酮“敲除”組顯示出與提取物組相同的心肌細胞保護作用，黃芪中黃酮類成分與心肌細胞保護作用無明顯相關性。Chen等[97]制備了不同的MIPs，分離出熱毒寧注射液中七種咖啡酸及其類似物，并將成分進行組合，研究組合物對脂多糖誘導的小鼠單核巨噬細胞白血病細胞(RAW264.7)中前列腺素E2生物合成的抑制作用。結果表明在一定范圍內，不同組合物可以產生協同的抗炎作用，但當濃度過高時，則產生拮抗作用，可能與不同成分相互競爭靶蛋白有關。采用分子印跡技術對中藥活性成分及相互間藥效作用機制的探討，為中藥有效成分藥理活性篩選提供新思路。MIPs“敲除”活性篩選流程見圖2。

圖2 MIPs“敲除”活性篩選流程

2.3 有毒成分的分離

有毒中藥理論是傳統中醫藥理論的重要組成部分，現代中藥藥理和毒性效應及其兩者的關系轉換研究已經成為中醫藥研究的關鍵科學問題，也是制約中醫藥學科發展的瓶頸。隨著中藥毒理學研究的不斷發展，對有毒中藥中毒性成分的確證、分離，從而達到減毒增效的目的，成為中藥研究的熱點。馬兜鈴酸廣泛存在于馬兜鈴以細辛屬的中藥中[98]。有研究表明馬兜鈴酸與肝癌的發生有“決定性關聯”[99]，因此，開發一種快速檢測和分離中藥中馬兜鈴酸的方法很有必要。Li等[100]采用分子印跡聚合技術功能化的磁性碳納米管(MCNT@AAI-MIPs)除去中藥中的馬兜鈴酸。首先通過溶劑熱法合成了功能化磁性碳納米管并在乙醇和水存在下，將模板分子與功能單體苯基三甲氧基硅烷(PTMOS)進行自組裝。以正硅酸乙酯(TEOS)為交聯劑，在功能化磁性碳納米管上涂覆馬兜鈴酸MIPs膜即得MCNT@AAI-MIPs。將2 mg MCNT@AAI-MIPs混懸于2 mL馬兜鈴酸乙腈溶液中(50μg·mL-1)，孵育一定時間(6～30 min)后，通過外部磁場分離吸附馬兜鈴酸的MCNT@AAI-MIPs，通過高效液相色譜法檢測分離后混懸液中馬兜鈴酸的含量計算吸附容量。吸附于MCNT@AAI-MIPs中的馬兜鈴酸通過大量的乙腈超聲解吸附。通過溶膠-凝膠法制備的分子印跡納米復合材料對馬兜鈴酸的吸附容量達到18.54 g·mg-1，15 min可達到吸附動力學平衡，印跡因子為3.17，檢測限和回收率都表明采用該技術可以高效地從中藥中分離出馬兜鈴酸。MCNT @AAI-MIPs合成步驟見圖3。何首烏作為傳統的中藥，其肝毒性和腎毒性問題近年來引起了廣泛的關注[101-102]。有研究表明，大黃素類衍生物是何首烏中主要的毒性成分，其在大鼠體內可引起嚴重的代謝紊亂而誘發肝臟毒性[103]。孫挺[104]采用超聲輔助提取法，獲得有效成分二苯乙烯苷含量較高，而毒性成分大黃素、大黃素甲醚含量低，進一步以大黃素和大黃素甲醚為模板制備MIPs，用于從提取物中除去大黃素和大黃素甲醚，達到“脫毒”的目的。該方法大黃素和大黃素甲醚去除率均為100%，二苯乙烯苷的保留率在(88.49±2.09)%以上，達到減毒增效的目的。近年來，隨著對中藥毒性成分的認識和研究不斷深入，明確中藥毒性的物質基礎，進一步實現減毒增效已經成為研究的熱點。中藥毒效關系與中藥多成分、多途徑、多靶點的整體性密切相關，不同種屬、產地、加工方式及炮制對中藥毒性成分均可能產生影響，將分子印跡技術應用于中藥毒性成分研究，實現微量成分的分離和檢測，有助于進一步明確中藥毒效關系。

圖3 MCNT@AAI-MIPs的合成步驟

2.4 代謝成分分離

中藥體內代謝化學研究對闡明中藥的有效性，探討有效成分的作用原理，解釋中藥復方配伍的合理性具有重要意義，為新的活性成分的發現、新藥合成及新的前體藥物的研制提供可貴的理論和實踐依據；此外，也是中藥成分藥代動力學和生物利用度研究的基礎和前提。但是，由于中藥成分復雜，每種單一成分含量較低，因此，代謝物的發現、提取和鑒定是中藥體內代謝的研究難點，分子印跡技術由于其高識別能力和高選擇性，在中藥體內代謝成分分離方面顯示出一定優勢。Cai等[105]采用人參皂苷Rb1為模板分子，制備了相應的磁性MIPs，并將其用于大鼠糞便中人參皂苷代謝物的特異性識別和選擇性富集。MIPs顯示出快速分離、吸附能力強、高選擇性以及快速結合動力學等特征。此外，結合線性離子阱與Orbitrap傅立葉掃描質譜法，確定或初步確定了26種原人參二醇組和32種原人參三醇組人參皂苷代謝物。Yang等[106]分別以多聚腺苷和大黃素-8-O-b-D-葡萄糖苷為模板分子制備了兩種MIPs，將其應用于大鼠血漿中虎杖提取物代謝產物的分離和富集，獲得17種茋類化合物和19種蒽醌類化合物。由于單組分含量低，體內代謝過程復雜，中藥代謝成分分析通常依賴于高精度檢測方法，對于微量甚至痕量代謝成分的分析有一定局限性。將分子印跡技術引入中藥代謝成分研究，在代謝成分特異性選擇和高效富集方面有著顯著的優勢。

3 展望

分子印跡技術用于中藥成分的分離是現代物理化學手段在中醫藥現代化系統工程中的有益嘗試，已經取得了一定的理論和實踐成果，但由于分子印跡技術發展時間不長，在中醫藥學科中的應用仍然存在很多問題。首先目前所制備的 MIPs主要采用非極性材料，識別的目標分子以疏水性為主，對于親水性目標分子的選擇性存在一定障礙。在水相反應體系中，水分子與模板分子競爭從而削弱或破壞模板分子與功能單體之間的非共價作用力，進一步限制了MIPs在中藥成分分離中的應用，急需克服。其次，MIPs與目標分子的結合速率還比較低，工業化制備MIPs可能存在均勻性差的弊端，快速高效的結合和解離還存在一定的技術壁壘，難以滿足工業化需求。再者，大多數功能單體只適用于小分子物質，對于生物大分子如蛋白質、酶，如何保證MIPs形成規則的可容納生物大分子的腔室結構以及在結合和解離過程中生物大分子的穩定性，尚需進一步探索。另外，分子印跡技術往往使用大量的有機試劑，不符合綠色化學的發展理念，因此，采用綠色技術和替代試劑也是研究的重點。隨著生物技術、電子技術、合成手段和現代分析檢測手段的迅猛發展，MIPs的合成、表征方法和理論系統將日臻完善，MIPs作為一種對目標分子高選擇性的新技術，對中藥活性物質的特異性分離有著明顯的優勢。將該技術應用于中藥活性物質的分離，不僅具有深刻的理論意義，還具有廣泛的應用前景。