基于網絡藥理學探討黃芪治療慢傳輸型便秘作用機制

楊金玉，王鳳飛，陸文洪，李帥軍*

(1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208；2.湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005)

慢傳輸型便秘(STC)是最常見的慢性便秘之一，其病因及發病機制尚不明確，可能與腸神經系統、Cajal間質細胞、激素、神經遞質、腸道菌群、精神心理、腸道平滑肌等因素相關[1]，多以結腸傳輸時間長，腸道蠕動減慢為特征。國外流行病學調查顯示[2-4]，慢性便秘的發病率呈逐年上升趨勢，且發病人群廣，已嚴重影響人們的生活質量。

中藥黃芪始載于《神農本草經》，具有補氣升陽、利水消腫、固表止汗、托瘡生肌等功效[5-6]?，F代藥理研究表明，黃芪含有黃芪皂苷、黃芪多糖、多種氨基酸等成分，在調節內分泌、抗衰老、抗腫瘤、抑菌及抑制病毒等方面具有重要作用[7]。其中所含的多糖氨基酸成分，通過增強腸蠕動及平滑肌張力，在改善便秘中發揮了重要作用[8]。臨床上常使用黃芪治療氣虛型便秘。邱月平[9]通過對比分析黃芪湯治療組與乳果糖對照組的臨床療效發現，治療組的總有效率達92%，說明黃芪湯可有效緩解便秘患者臨床癥狀。氣血虧虛是便秘的基礎狀態，調態以“補氣養血”為法，黃芪、當歸為首選中藥。金益等[10]通過文獻研究發現，當歸-黃芪是最常出現的配伍藥對之一，二者配伍可共同發揮補血活血、養血潤腸的作用。

中藥具有多成分、多作用靶點及多作用途徑的特點[11]。黃芪具有治療慢傳輸型便秘的作用，但其成分、靶點與作用機制等尚不明確。因此，本研究以黃芪為研究對象，運用網絡藥理學方法篩選黃芪治療STC的有效成分及潛在靶點，并進行生物信息學分析，得到黃芪分子作用機制，為進一步理論研究及臨床應用提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 軟件與數據庫

利用 Cytoscape 3.7.2軟件構建網絡可視化圖并進行數據分析，使用的主要數據庫為TCMSP、GeneCards、OMIM、UniProt、Venn、STRING、David。

1.2 黃芪活性成分的篩選及其靶點的獲取

在TCMSP(http：//tcmspw.com/tcmsp.php)數據庫中查詢黃芪的化學成分，口服生物利用度 (OB)及藥物相似度 (DL)為常用的活性成分篩選指標[12-13]，設置OB≥30%、DL≥0.18 得到相關活性成分，點擊“Related Targets”查找所需活性成分相關的蛋白靶點，并使用UniProt數據庫[14]查詢靶點蛋白對應的基因，對查詢的基因進行歸納整理。

1.3 STC疾病相關靶基因的獲取

以“slow transit constipation”為關鍵詞在GeneCards及OMIM數據庫檢索相關疾病基因，將其進行整合，刪除重復值，并歸納整理最終獲得的靶基因。

1.4 黃芪活性成分與STC靶點的交集

將黃芪有效成分的相關靶點與STC的靶點導入Venn平臺，得到黃芪活性成分與STC的交集靶點，并繪制Venn圖。

1.5 蛋白相互作用 (PPI)網絡構建

將“1.4”中得到的交集靶點導入STRING數據庫，選擇物種為“Homo sapiens”(人源)，設置“minimum required interaction score”為“Medium confidence=0.4”，其余參數為默認值，得到蛋白互作PPI網絡，下載tsv文件，通過Cytoscape 3.7.2軟件進行拓撲分析并篩選關鍵靶點。

1.6 GO富集功能分析與KEGG通路富集分析

為進一步研究黃芪作用機制，將交集后所得的靶點導入David數據庫中進行GO富集功能分析，包括生物過程(BP)、細胞組分(CC)及分子功能(MF)，并進行KEGG通路富集分析，得到黃芪治療STC的主要作用通路，進行可視化處理，探討黃芪治療STC可能的作用機制。

2 結果

2.1 黃芪活性成分篩選

在TCMSP數據庫中以“黃芪”為檢索詞進行查詢，共得到87個活性成分，設置OB≥30%、DL≥0.18，初步篩選出20個活性成分，見表1。

表1 黃芪活性成分基本信息

2.2 黃芪活性成分靶基因的獲取及活性成分-基因靶點網絡的構建

將4個未檢索到靶蛋白的活性成分剔除后得到16個有效活性成分，將檢索到的靶蛋白進行歸納整理，使用 Uniprot 數據庫將檢索到的所有靶點蛋白校正為官方名稱 (Officical Symbol)，刪除重復項后得到 172個作用靶點。將16個有效成分，172個相關靶點導入Cytoscape 3.7.2 軟件構建黃芪“活性成分-基因靶點”網絡圖(見圖1)。16個菱形表示黃芪的活性成分，172個三角形表示黃芪對應的作用靶點，365條邊代表靶點及化學成分之間的相互作用，體現了黃芪多成分、多靶點的特點。經計算，槲皮素(quercetin)、山柰酚(kaempferol)、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇(7-O-methylisomucronulatol)、刺芒柄花素(formononetin)、異鼠李素(isorhamnetin)的Degree值較高，見表2。

表2 關鍵活性成分

2.3 STC疾病相關靶基因的獲取

在Gene Cards、OMIM數據庫中檢索關鍵詞“slow transit constipation”，獲取STC的潛在靶點，交集映射，去除重復值后，最終整合STC疾病靶點1 824個。

2.4 黃芪活性成分靶點與STC靶點的交集

通過繪制韋恩圖進行交集分析，得到藥物靶點中與STC相關的靶點共113個，包括MMP2、SLC6A2、HSPB1、PLAU、NOS2等，表明黃芪可多靶點治療STC，見圖2。

圖2 黃芪靶點與STC相關靶點韋恩圖

2.5 蛋白相互作用 (PPI)網絡構建

PPI網絡中有112個節點(其中有1個靶點未與其他靶點發生相互作用)，2 069條連線，見圖3。對排序均在前20的度值及介數的靶點進行交集，共篩選出17個度值與介數的靶點，提示這些靶點在PPI網絡中起關鍵作用，可能是黃芪治療STC的關鍵靶點，見表3。

圖3 靶蛋白PPI網絡圖

表3 關鍵靶點拓撲參數

2.6 GO富集功能分析與KEGG 通路富集分析

利用DAVID數據庫進行GO富集功能分析，共獲得287條GO條目(P<0.01)，其中生物過程(BP)條目218條，分子功能(CC)條目22條，細胞成分(MF)條目47條。用R軟件繪制BP，CC及MF富集前10位的條形圖見圖4、圖5、圖6。其中BP涉及RNA聚合酶Ⅱ啟動子對轉錄的正調控(Positive regulation of transcription from RNA polymerase II promoter)、對藥物的反應(Response to drug)、凋亡過程的負調控(Negative regulation of apoptotic process)與轉錄的正向調節，DNA模板(Positive regulation of transcription，DNA-templated)、缺乏配體的外源性凋亡信號通路(Extrinsic apoptotic signaling pathway in absence of ligand)等過程。CC涉及細胞外液(Extracellular space)、膜筏(Membrane raft)、胞外片段(Extracellular region)、細胞質(Cytosol)、細胞質核周區(Perinuclear region of cytoplasm)等部分。MF涉及酶結合(Enzyme binding)、蛋白結合(Protein binding)、相同蛋白質結合(Identical protein binding)、轉錄因子結合(Transcription factor binding)與蛋白激酶結合(Protein kinase binding)、蛋白質異源二聚體活性(Protein heterodimerization activity)等過程。KEGG分析共獲得117條信號通路，有84條通路的P<0.01，按基因富集數進行排序，繪制前15條通路的氣泡圖見圖7。其靶點在乙型肝炎、甲型流感、HTLV-I感染、恰加斯病(美國錐蟲病)等疾病與癌癥信號通路、PI3K/Akt信號通路、TNF信號通路、MAPK 信號通路等上富集較多。

圖4 GO-BP分析結果條形圖

圖5 GO-CC分析結果條形圖

圖6 GO-MF分析結果條形圖

圖7 KEGG富集分析的前15條通路圖

3 討論

慢傳輸型便秘(STC)因其病理生理機制復雜，目前其治療尚未取得滿意的療效。中醫根據其發病的病因病機進行多層次、多角度的辨證施治，治療效果較好[15-16]。中醫認為STC以本虛標實為主，多以氣虛型為主要證候，臨床治療以虛者補之為主要治則。相關文獻[17]表明，以黃芪為主的方劑可有效改善氣虛型功能性便秘，但其有效成分及作用機制尚不明確。本研究使用TCMSP數據庫篩選出16種有效活性成分，包括丁子香萜、華良姜素、常春藤皂苷元、異鼠李素、3，9-二-O-甲基尼森香豌豆紫檀酚、7-O-甲基-異微凸劍葉莎醇、槲皮素、山柰酚、刺芒柄花素等，其中槲皮素是關聯靶點最多且Dgree值最高的活性成分。槲皮素是天然存在的黃酮類物質，槲皮素通過增加擬桿菌及減少變形桿菌，調節腸道菌群失衡狀態，從而恢復宿主微生物的平衡[18]。陳櫻萌等[19]通過研究小鼠體內外槲皮素對腸道菌群的調節作用，結果表明，槲皮素可調節腸道菌群失調狀態，可一定程度緩解消化系統臨床癥狀。張晉蔚[20]研究表明，槲皮素可降低結腸黏膜水通道蛋白表達，減少對腸道內容物水分吸收，從而起到緩解慢性傳輸性便秘癥狀的作用。

PPI網絡分析結果發現，AKT1、TP53、IL6、VEGFA、CASP3、MAPK8等17個靶標可能是黃芪治療STC的關鍵靶點。AKT是一種蛋白激酶，它是P13K信號傳導通路下游一個重要的激酶，分為AKT1、AKT2、AKT3三個亞型。AKT參與P13K/AKT/mTOR細胞信號傳導途徑，通過促進ICC增殖、抑制ICC凋亡從而發揮治療STC的作用[21]。康倩鋒[22]研究表明，可通過降低便秘患者炎癥因子水平，包括 IL-6 等，改善便秘狀態。MAPK可以調節細胞的增殖、分化及凋亡[23]。MAPK通過調節水通道蛋白(AQPs)在細胞中的表達從而起到促進調節水分運輸的作用[24]。TP53、VEGFA、CASP3共同調節細胞增殖和凋亡，富集的信號通路多樣，包括癌癥信號通路、PI3K/AKT 信號通路、MAPK信號通路。

GO分析結果表明，黃芪可能在RNA聚合酶Ⅱ啟動子對轉錄的正調控、對藥物的反應、凋亡過程的負調控、轉錄的正向調節、DNA模板、缺乏配體的外源性凋亡信號通路等過程中發揮治療STC的功效。KEGG結果提示，黃芪治療STC的主要通路為癌癥信號通路、PI3K/Akt信號通路、TNF信號通路、MAPK 信號通路。PI3K激活后產生PIP3與AKT結合，Akt磷酸化后可調節細胞生長因子，促進細胞的生長、增殖，抑制細胞凋亡；P-Akt表達明顯降低可使結腸組織NO含量增多，可抑制平滑肌收縮，減少胃腸道蠕動[25]。研究表明，水通道蛋白 (AQPs)通過調整結腸內生物膜的透水性從而維持結腸內水代謝平衡，而 MAPK信號通路中 ERK、JNK、p38 MAPK的激活與水通道蛋白的表達有一定的相關性，與STC的發生緊密相關[26]。盡管癌癥信號通路及TNF信號通路在STC的發生、發展中發揮著重要作用，但目前對其研究較少，有關作用機制尚不清楚，今后可從相關通路著手進行研究。

本研究通過網絡藥理學探討黃芪治療STC的分子機制，結果顯示，黃芪中槲皮素等16個活性成分通過AKT1、TP53、IL6等113個作用靶點調控PI3K/AKT信號通路、MAPK信號通路等84條信號通路發揮治療STC的作用，體現了黃芪多成分、多靶點、多通路協調發揮促進細胞增殖、誘導凋亡、減輕炎癥反應等藥理作用治療STC的特點。而黃芪是否通過這些核心靶點與通路發揮治療STC的功效，還需進一步實驗研究證實。