金毛狗脊指紋圖譜前處理方法探索

陸燕萍，徐佳蘭，彭小晶，何 嫣，鞏曉宇*，趙 敏

(1.深圳市龍崗區人民醫院，廣東 深圳 518172；2.湖南網絡工程職業學院，湖南 長沙 410018)

狗脊(Cibotii Rhizoma)為蚌殼蕨科植物金毛狗脊(Cibotiumbarometz(L.)J.Sm.)干燥根莖。作為國家二級保護植物金毛狗脊[1]生長于山腳陰濕緩坡或溝谷密林下陰濕的酸性土壤，主要分布于熱帶至亞熱帶地區。其資源分布廣，福建、廣西、貴州、云南、廣東、江西、湖南、四川、重慶、浙江等地均有出產，其中以福建、廣西、貴州、云南為多[2]。狗脊為《中國藥典》收載的常用中藥，功效為祛風濕、補肝腎、強腰膝等，臨床用于治療風濕痹痛、腰膝酸軟、下肢無力[3]。其主要化學成分為水溶性酚酸類(以原兒茶酸為代表)、蕨素類、黃酮類、揮發油等活性成分[4]，現代藥理研究表明，具有抗骨質疏松、抑制血小板聚集、抗炎、抗風濕、保肝、抗氧化及抗癌等藥理活性[5-10]。《中國藥典》(2020年版)[3]以原兒茶酸為指標進行含量測定作為主要的質量控制方法，并不能完全反映狗脊多組分特征。本項目通過建立可反映中藥狗脊多組分特征的HPLC色譜指紋圖譜，用于狗脊種源鑒別、種植、加工、炮制、生產、檢驗和研究全過程的質量控制，為有效控制中藥狗脊質量、提高狗脊質量標準提供依據。本文通過建立狗脊水溶性酚酸類多成分同時檢測的基礎上，運用正交實驗設計及方差分析優化狗脊HPLC色譜指紋圖譜樣品前處理方法，為后期建立合理的狗脊HPLC色譜指紋圖譜提供實驗依據。

1 儀器與材料

儀器與試藥：Agilent 1260高效液相色譜儀(Agilent OpenLAB 色譜工作站帶四元泵、自動進樣器、柱溫箱、DAD檢測器)，FA2004型萬分之一電子分析天平(上海天平儀器廠)，VGT-01型超聲波清洗器(深圳市威固特超聲波科技開發有限公司)，XK96-A快速混勻器(姜堰市新康醫療器械有限公司)，甲醇、乙腈為色譜純(德國MERCK公司)；Milli Q 純化水系統制備實驗用水，其他試劑均為分析純。

5-羥甲基糖醛(11626-202013，5-HMF)、原兒茶酸(110809-201906)、原兒茶醛(110810-201909)對照品均購置于中國食品藥品檢定研究院，純度經HPLC檢測大于99.9%。狗脊藥材(產地廣西玉林)，購于深圳一致醫藥公司，經深圳市龍崗醫院陸燕萍主任藥師鑒定為蚌殼蕨科植物金毛狗脊的干燥根莖；樣本存放于深圳市龍崗醫院存樣標本室。

2 方法與結果

2.1 檢測方法的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5μm)連接ZobaxC18(2.5 mm×4.6 mm，5μm)保護柱；以甲醇為流動相A，0.1%冰醋酸水溶液為流動相B，按梯度0.0～38.0 min，流動相A(%)5；38.0～48.0 min，流動相A(%)5～100洗脫；流速1.0 mL/min；進樣量10μL；柱溫30 ℃；檢測波長260 nm。此色譜條件，各成分均達到基線分離，理論塔板數均大于2 000，典型色譜圖具體見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品5-HMF、原兒茶酸、原兒茶醛適量，加甲醇-1%冰醋酸(70∶30)溶液配制成濃度分別為630.0、450.0及760.0μg/mL的混合對照品儲備液(母液)于4 ℃冰箱保存備用。上述儲備液精密吸取5 mL于100 mL容量瓶中，加入甲醇-1%冰醋酸(70∶30)溶液稀釋至刻度，邊加邊搖勻，即得含上述成分分別為31.50、22.50及38.00μg/mL的混合對照品工作溶液，待用。

2.1.3 供試品溶液的制備 狗脊藥材粉碎后過三號篩，取粉末約0.4 g，精密稱定，置10mL容量瓶中，精密加入甲醇-1%冰醋酸溶液(70∶30)至達到刻度線，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再次稱定質量，用甲醇-1%冰醋酸溶液(70∶30)補足減失的質量，搖勻，濾過，取濾液即得。

2.1.4 標準曲線、線性范圍及定量限(LOQ)/檢測限(LOD) 上述混合對照品母液分別稀釋5、10、20、50、100、200倍，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，分別記錄其峰面積。橫坐標為各成分的進樣量對應峰面積為縱坐標，進行線性回歸計算。取上述對照品工作溶液，依法測定其色譜峰信噪比(S/N)，以S/N為10和3相應的濃度分別作為其LOQ與LOD。各成分線性范圍及LOQ/LOD具體見表1。從所得結果看，在相應濃度范圍內各成分線性關系良好，靈敏度表現良好。

表1 線性范圍及定量限(LOQ)/檢測限(LOD)結果

2.1.4 精密度試驗 精密吸取上述混合對照品工作溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6次，分別記錄峰面積。5-HMF、原兒茶酸、原兒茶醛對照品峰面積相對標準偏差(RSD)值分別為1.53%、1.66%、1.22%，表明該方法精密度良好。

2.1.5 回收率實驗 按“2.1.3”項下方法，稱取同一批次狗脊細粉6份，每份1 g，加入等量各對照品溶液，平行制備樣品，并按“2.1.1”項下色譜條件進行測定；回收率按公式(%)=(C-A)/B×100%(A：供試品所含被測成分量；B：加入對照品量；C：實測值)。5-HMF、原兒茶酸、原兒茶醛回收率分別為99.18%、100.17%、95.12%；RSD值分別為2.45%、1.89%、2.41%，表明該方法準確性良好。

2.1.6 穩定性實驗 室溫下取對照品工作溶液密封儲存于進樣瓶中，分別于0、2、6、10、16、24 h 按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定。結果顯示5-HMF、原兒茶酸、原兒茶醛對照品峰面積RSD值分別為1.95%、1.84%、1.72%，表明在該溶液條件下，各成分24 h內穩定性良好。

2.1.6 重復性試驗 按“2.1.3”項下方法，稱取同一批次狗脊細粉6份，每份1 g，加入等量各對照品溶液，平行制備樣品，并按“2.1.1”項下色譜條件進行測定。結果顯示樣品中5-HMF、原兒茶酸、原兒茶醛平均含量分別為0.305%(RSD2.73%)、0.039%(RSD3.51%)、0.021%(RSD3.24%)，表明該方法重復性良好。

2.2 處理方法研究

2.2.1 單因素實驗 其他條件不變，分別考察溶劑類型、溶劑比例、超聲時間和次數對3個成分(5-HMF、原兒茶酸、原兒茶醛)總得率(Tc)的影響。

(1)溶劑類型：按“2.1.3”項下方法，準確稱取0.40 g狗脊粉5份，分別加入甲醇、甲醇-1%冰醋酸(70∶30)、乙腈、乙腈-1%冰醋酸(70∶30)、含1%冰醋酸水溶液進行超聲處理30 min。結果顯示，添加30∶% 1%冰醋酸的混合溶劑處理時，Tc值最高，其次為含1%冰醋酸水溶液，純有機溶劑最低。甲醇-1%冰醋酸與乙腈-1%冰醋酸無明顯差異。

(2)溶劑比例：按“2.1.3”項下方法，準確稱取0.40 g狗脊粉5份，按甲醇與含1%冰醋酸水溶液比例10∶90、30∶70、50∶50、70∶30、90∶10進行超聲處理30 min。結果顯示，甲醇與含1%冰醋酸水溶液比例70∶30時，Tc值最高。

(3)超聲處理時間：按“2.1.3”項下方法，準確稱取0.40 g狗脊粉5份，加甲醇-1%冰醋酸(70∶30)溶劑超聲處理10、20、30、40、50 min。結果顯示，超聲處理時間為50 min時，Tc值最高。

(4)超聲處理次數：按“2.1.3”項下方法，準確稱取0.40 g狗脊粉3份，加甲醇-1%冰醋酸(70∶30)溶劑超聲處理次數分別為1～3次，每次30 min 。結果顯示，處理次數越多，Tc值越高。

2.2.2 正交設計及方差分析 在方法學考察和單因素實驗的基礎上，為優化處理方法的工藝條件，以溶劑比例、超聲處理時間及次數3個因素為考察因子，Tc值為參考指標，具體實驗按L9(34)正交實驗表，見表2。正交實驗結果及方差分析結果見表3和表4。

表2 正交實驗因素水平

表3 正交實驗結果

表4 方差分析

由表2、3可看出，前處理方法以Tc值作為考察指標，各因素對方法的影響大小依次為A>C>B，溶劑比例對方法影響最大，超聲處理次數對方法影響最小。在實驗范圍內，最佳的條件為A3B1C2，即樣品加入甲醇-1%冰醋酸溶液(70∶30)超聲處理30 min，1次。

3 討論

以“中藥色譜指紋圖譜方法”鑒別中藥的真偽，控制其質量是較傳統的方法，更能客觀地反映中藥物質基礎的整體觀，是更為科學、有效的質控方法。本方法已被國家正式推行[11]。狗脊化學成分為水溶性酚酸類、蕨素類、黃酮類、揮發油等多種活性成分[2-8]，狗脊中抗炎、抗氧化的主要有效成分為原兒茶酸、原兒茶醛[12-14]，現行《中國藥典》采用原兒茶酸作為狗脊質量控制標準，但5-HMF也具有改善認知功能、抗氧化的活性[15]，而且從藥材含量上看，5-HMF含量要遠遠高于原兒茶酸、原兒茶醛，其色譜行為表現峰面積也遠遠大于原兒茶酸、原兒茶醛[1]。同時多種植物中都含有原兒茶酸，單以原兒茶酸作為質量控制指標專屬性不強。因此，在進行狗脊的指紋圖譜研究要綜合考慮作為主要特征峰原兒茶酸、原兒茶醛及5-HMF的色譜行為。本文即在建立5-HMF、原兒茶酸及原兒茶醛的多成分定量測定的基礎上，以3個成分總含量綜合評價藥材前處理方法，本方法專屬性高，有利于狗脊指紋圖譜質控方法的建立。

檢測波長選擇。5-HMF 的最大吸收波長為280 nm，但考慮在此波長下5-HMF靈敏度過高而影響其他2個成分的色譜行為，故選擇5-HMF吸收相對較弱的260 nm 進行測定。

流動相選擇。本實驗系統地篩選了甲醇、乙腈及不同濃度各種有機酸、緩沖鹽的配伍對各成分的影響，最終確定有機相為甲醇、水相為含0.1%冰醋酸水溶液時，各待測組分分離度高且色譜峰峰形最佳，且溶劑類型有藥材處理方法一致，有利于操作。