育齡期女性乳腺癌中TIPE2 的表達與VEGF、增殖能力的相關性分析

趙志廉，陸玲玲，郭 曼，菅鳳國，付振鵬，劉明海

（昌邑市婦幼保健院病理科1，婦產科2，超聲科3，外科4，山東 昌邑 261300）

乳腺癌（breast cancer）是激素依賴性腫瘤，也是全球范圍內女性患病率最高的惡性腫瘤[1]。乳腺癌的發病率逐年升高，嚴重威脅中國女性的生命健康。乳腺癌是育齡期女性癌癥導致死亡的首要原因[2]。育齡期女性由于其特殊的性質，乳腺癌可嚴重影響其身心健康。目前乳腺癌的治療仍存在諸多問題，尤其對于妊娠期合并乳腺癌的治療，需要多學科聯合進行[3]。近半個世紀以來，世界各國的多項研究已證實，乳腺癌篩查是提高早期診斷率、患者生存率及生存質量的最為有效的方法。世界衛生組織已明確將早期乳腺癌列為可治愈性疾病，早期診斷早期治療是提高乳腺癌治愈率的最佳途徑[1]。尋找用于乳腺癌早期診斷和評估預后的新的臨床指標是癌癥研究的難題和熱點。腫瘤壞死因子-α-誘導蛋白8（TNFAIP8）家族又稱為TIPE 家族，包括TIPE、TIPE1、TIPE2 和TIPE3。人正常的TIPE2 可以表達于多種免疫細胞，參與免疫反應的調節。它也表達于多種非免疫細胞中，包括腦的神經元細胞、肝細胞、食管鱗狀上皮細胞等[4]，這提示TIPE2 不僅參與免疫調節，還有其他的功能。研究指出[5-8]，TIPE2 在惡性腫瘤中出現異常表達。在乳腺癌、食管癌、胃癌、直腸腺癌等研究中發現，TIPE2 在癌組織中明顯低表達。TIPE2 在上述腫瘤的生長過程中可能抑制腫瘤的發生，并且與腫瘤的侵襲性、轉移等惡性生物學行為呈負相關。本實驗通過免疫組織化學方法檢測育齡期女性乳腺癌組織中TIPE2、VEGF、β-catenin、cyclinD1 的表達情況，并分析TIPE2、VEGF、βcatenin、cyclinD1 和各臨床病理參數之間的意義及TIPE2與VEGF、β-catenin、cyclinD1 之間的相關性，進一步探討TIPE2 在育齡期女性乳腺癌發生發展過程中的機制。

1 材料與方法

1.1 材料來源 選取2012 年1 月-2017 年8 月昌邑市婦幼保健院病理科術前未行任何治療的乳腺浸潤性導管癌標本100例作為為實驗組，均為育齡期女性，年齡23～47歲，平均年齡（37.50±6.25）歲。術后常規病理診斷為浸潤性導管癌。同時隨機選取30例實驗組距離癌旁1 cm 的正常乳腺組織作為對照組。100例標本中，年齡≥37歲63例，＜37歲37例。不伴有淋巴結轉移者62例，伴有淋巴結轉移者38例；浸潤性導管癌Ⅰ級9例，浸潤性導管癌Ⅱ、Ⅲ級91例；同時按照TNM分期標準進行分期，Ⅰ～Ⅱ期65例，Ⅲ～Ⅳ期35例。Ki-67 高表達者58例，Ki-67低表達者42例。ER 高表達者66例，ER 低表達者34例。PR 高表達者59例，PR 低表達者41例。Her-2 高表達者36例，HER-2 低表達者64例。腫瘤＞2 cm 者32例，≤2 cm 者68例。

1.2 免疫組化染色 所有切除的標本采用福爾馬林固定。TIPE2、VEGF、β-catenin、cyclinD1 兔抗人多克隆抗體（工作濃度1∶50），均買自武漢三鷹生物科技有限公司。即用型ER、PR、HER-2、Ki-67 抗體買自福建邁新生物技術有限公司。所有乳腺癌蠟塊標本均經兩位病理醫師獨立確診。常規石蠟4 μm 切片，免疫組織組織化學方法采用SP 法。切片在70 ℃烤箱中烤2 h，經過二甲苯、無水乙醇、梯度酒精、蒸餾水進行脫蠟水化，檸檬酸pH=6.0 高溫高壓修復4 min，然后滴上適當劑量的一抗工作液，放入濕盒中，并放于4 ℃冰箱過夜。經PBS 溶液沖洗3 min，共3 次。加入二抗，37 ℃孵育30 min。滴加適量結合有辣根過氧化物酶的生物素試劑，然后用PBS 溶液沖洗。DAB 顯色，蒸餾水充分沖洗，蘇木素染細胞核1 min左右，蒸餾水沖洗，PBS 返藍。用PBS 液替代一抗作為陰性對照。

1.3 觀察指標 比較不同年齡、TNM分期、浸潤程度、腫塊大小、Ki-67、ER、PR、HER-2 陽性表達患者的TIPE2、VEGF、β-catenin 和cyclinD1 表達情況，分析乳腺癌組織中TIPE2 的表達與VEGF、β-catenin、cyclinD1 的相關性。

1.4 結果判定 依據美國臨床腫瘤學會ASCO分級對TIPE2、VEGF、β -catenin、cyclinD1、ER、PR、HER -2、Ki-67 行結果判讀。TIPE2、VEGF 陽性：呈棕黃色顆粒定位在細胞漿；ER、PR、Ki-67、cyclinD1 陽性：呈棕黃色顆粒定位在細胞核；HER-2、β-catenin 陽性：呈棕黃色顆粒定位在細胞膜。根據染色陽性的腫瘤細胞面積＜5%、5%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%，分別計數為0、1、2、3、4分。根據腫瘤細胞著色強度分別標記為-、+、++、+++，對應計數為0、1、2、3分。得到的兩組數值相乘，＜8分判讀為低表達，≥8分判讀為高表達。

1.5 統計學分析 數據采用SPSS 16.0 軟件處理，計量資料采用（±s）表示，組間比較行t檢驗；計數資料采用[n（%）]表示，行χ2檢驗，相關性采用Spearman相關性分析，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TIPE2、VEGF、β-catenin、cyclinD1 在乳腺癌中的表達 乳腺浸潤性導管癌在顯微鏡下呈異常的導管癌細胞在纖維間質中浸潤性生長，排列成腺樣結構或實體團塊。TIPE2、VEGF 陽性：呈棕黃色顆粒定位在乳腺癌細胞的細胞漿；ER、PR、Ki-67、cyclinD1 陽性：呈棕黃色顆粒定位在乳腺癌細胞的細胞核；HER-2、β-catenin 陽性：呈棕黃色顆粒定位在乳腺癌細胞的細胞膜。TIPE2 在乳育齡期女性腺癌組織中呈低表達，VEGF、β-catenin、cyclinD1 在育齡期女性乳腺癌組織中呈高表達，見圖1。

圖1 正常乳腺組織及乳腺癌免疫組化表達（×400）

2.2 TIPE2、VEGF、β-catenin、cyclinD1與臨床病理參數間的關系 TIPE2 在乳腺癌組織中呈低表達，低于正常乳腺組織，差異有統計學意義（P＜0.05）；VEGF、β-catenin、cyclinD1 在乳腺癌組織中呈高表達，高于正常乳腺組織，差異有統計學意義（P＜0.05）。TIPE2、VEGF、β-catenin、cyclinD1 在乳腺癌組織中的表達分別與腫瘤TNM分期、淋巴結轉移、組織學分級、Ki-67 指數高相關（P＜0.05），但與ER、PR、HER-2的表達、腫瘤大小、年齡無關（P＞0.05），見表1。

表1 乳腺癌中TIPE2 表達與臨床病理參數的關系（n）

2.3 TIPE2、VEGF、β-catenin、cyclinD1 間的相關性TIPE2 的表達分別與VEGF（r=-0.326，P＜0.001）、β-catenin（r=-0.208，P＝0.019）、cyclinD1（r=-0.295，P＝0.002）的表達呈負相關。VEGF 的表達分別與β-catenin（r=0.349，P＜0.001）、cyclinD1（r=0.298，P＝0.001）的表達呈正相關，β-catenin 的表達與cyclinD1（r=0.285，P＝0.002）的表達呈正相關，見圖2。

圖2 TIPE2、VEGF、β-catenin、cyclinD1 之間的相關性

3 討論

根據世界衛生組織的統計，我國女性乳腺癌發病率和死亡率在全球處于比較低的水平，但近年來呈迅速增長的趨勢，尤其是農村地區近10 年來上升趨勢明顯。育齡期乳腺癌在我國農村發病率較高，早期缺乏明顯癥狀，易被漏診，治療效果較差[9]。乳腺癌的早期發現和早期治療是當今醫學界研究的重點。

TIPE2 約21 kDa，是一種新發現的與caspase-8結合的天然免疫和適應性免疫的負性免疫調節因子。TIPE2 在免疫組織和非免疫組織中均有表達，與caspase-8 的結合可抑制活化蛋白-1（AP-1）和核因子-κB（NF-κB）的活性，最終促進Fas 誘導的免疫細胞凋亡，從而參與機體的免疫穩態[10]。在感染性和自身免疫性疾病患者中，TIPE2 顯著下調，TIPE2 的缺失導致嚴重的炎癥疾病。近年來，越來越多的證據表明TIPE2 是一種理想的生物標志物，在多種腫瘤類型中起到抑瘤作用[11]。TIPE2 的低表達與多種上皮源性惡性腫瘤預后不良有關，包括結直腸癌、食管鱗狀細胞癌、胃癌、肺癌[5-8]。由此可見，TIPE2 在癌癥中作為一個抑癌基因抑制腫瘤的發生發展，并可能作為評估預后的獨立指標。本實驗通過免疫組織化學方法結果進一步證明，TIPE2 在育齡期女性乳腺癌組織中呈現低表達，可能參與抑癌癌癥發展的過程。

對于TIPE2 在腫瘤中的作用機制，近年也有深入的研究。Wnt 信號通路在細胞的分化、增殖和凋亡等生理過程中，以及在細胞癌變、腫瘤侵襲等病理過程中均發揮了重要的調控作用。β-catenin 介導的信號通路是Wnt 信號傳導通路中的經典信號通路，當Wnt 信號途徑被激活時，β-catenin 由于細胞分泌的Wnt 蛋白增多，影響β-catenin 的降解，大量沉積在胞質中，后進入細胞核并與TCF 因子結合，從而促進Wnt 靶基因的表達，如c-Myc 和cyclinD1。CyclinD1 是β-catenin 重要的下游靶基因[12]。TIPE2 可能通過Wnt/β-catenin 信號通路促進人直腸腺癌細胞凋亡[8]。磷酯酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）是調節細胞生存和增殖的重要因子。Akt/PKB 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，作為PI3 激酶的下游調節因子，是目前公認的調節細胞細胞凋亡重要的途徑。TIPE2 過表達可通過抑制PI3K/Akt 信號通路抑制前列腺癌細胞的增殖，遷移和侵襲[13]。

血管內皮生長因子（VEGF）是一種分子量約為45 kDa 的同二聚糖蛋白，是新生血管生成的關鍵介質。VEGF 是腫瘤血管生成的關鍵介質，其表達受癌基因表達、多種生長因子及缺氧等因素的上調。血管生成對癌癥的發展和生長至關重要，VEGF 作用下形成的腫瘤血管在結構和功能上都有異常，如血管形狀不規則，彎曲，有盲端，不形成小靜脈、小動脈和毛細血管，也有滲漏和出血，導致間質高壓。這些特點意味著腫瘤血流不理想，導致缺氧，進一步產生VEGF。VEGF 在腫瘤血管生成中的中心作用使其成為抗腫瘤治療的合理靶點[14-16]。特異性短干擾RNA敲除TIPE2 可提高TNF-α、IL-1β 和VEGF 的表達水平，特別是在脂多糖刺激下。考慮到血管內皮生長因子在新生血管最后階段的重要作用，抗炎TIPE2也具有抗血管生成作用[17]。在肺癌的發生發展研究機制中發現[18]，TIPE2 通過抑制Rac1 的激活，進而減弱其下游效應，包括F-actin 聚合和VEGF 表達，從而抑制腫瘤的侵襲性和血管生成。

本實驗發現，TIPE2 在育齡期女性乳腺癌組織中的表達低于周圍正常乳腺組織，而VEGF、βcatenin、cyclinD1 在育齡期女性乳腺癌組織中的表達高于周圍正常乳腺組織。同時，TIPE2、VEGF、βcatenin、cyclinD1 的異常表達與乳腺癌的組織分級、TNM分期、Ki-67 高表達臨床病理參數相關，表明TIPE2、VEGF、β-catenin、cyclinD1 在一定程度上作用于乳腺癌的發生發展。相關性分析顯示，乳腺癌中TIPE2 的表達分別與VEGF、β-catenin、cyclinD1的表達呈負相關，VEGF與β-catenin、cyclinD1 的表達呈正相關，而β-catenin 的表達與cyclinD1 的表達也呈正相關。這說明TIPE2 在乳腺癌中的作用機制與VEGF、β-catenin 和cyclinD1 的表達相關，可以推斷KPNA2 通過Wnt 通路和VEGF 介導的血管形成作用于乳腺癌的侵襲發展過程。

乳腺癌現在的治療主要通過傳統的手術、放療、化療、內分泌治療。這對于育齡期女性的身心健康影響重大。如能及時發現并確診，并給予合理的治療，可提高育齡期乳腺癌患者的生存率及生存質量[19，20]，因此需要進一步尋找新的用于臨床治療的基因靶點。

綜上所述，在育齡期女性乳腺浸潤性導管癌中，TIPE2 的低表達與多種臨床病理特征相關，TIPE2可能成為一個重要的靶點分子，通過Wnt 通路和VEGF 介導的血管形成過程從而影響乳腺癌的侵襲發展。但Wnt 通路如何調控VEGF 的作用，還需要進一步研究。后續研究方向是通過更復雜的體內外實驗明確TIPE2 在乳腺癌中與Wnt 通路和VEGF之間的作用機制，構建TIPE2 參與細胞信號通路的模型，利于對育齡期女性乳腺癌的評估和臨床治療提供新的研究方向。