建鯉腸道中4種胞內(nèi)酶和黏液細(xì)胞的分布及組織化學(xué)定位

陳坤，孫敬鋒，韓卓然，陳麗梅，胡秀彩，呂愛(ài)軍

(天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院,天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384)

腸道不僅是魚(yú)類(lèi)消化、吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的主要場(chǎng)所，同時(shí)承擔(dān)重要的免疫防御功能。尤其是腸道黏膜系統(tǒng)，除了廣泛參與水、離子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收，也是各種病原感染的主要入侵部位[1-3]。因此，腸道內(nèi)環(huán)境平衡對(duì)于維持宿主健康和生長(zhǎng)至關(guān)重要[4]。

動(dòng)物組織器官中存在多種具有不同生理功能的胞內(nèi)酶，這些胞內(nèi)酶在魚(yú)類(lèi)消化道組織中廣泛分布，在維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。在烏鱧Ophiocephalusargus[5]和泥鰍Misgurnusanguillicaudatus[6]的消化道黏膜中廣泛存在酸性磷酸酶(ACP)、堿性磷酸酶(ALP)、腺苷三磷酸酶(ATPase)、非特異性酯酶(NSE)、過(guò)氧化物酶(POD)、琥珀酸脫氫酶(SDH)等重要胞內(nèi)酶，這些酶在其食道、胃賁門(mén)、胃體、胃幽門(mén)、前腸、中腸、后腸等部位具有不同活性。對(duì)半滑舌鰨Cynoglossussemilaevis[7]和錦鯉Cyprinuscarpiovar. koi[8]的研究發(fā)現(xiàn)，ACP、ALP、POD、NSE的分布遍及整個(gè)腸道組織，但其活性和分布特點(diǎn)在這兩種魚(yú)類(lèi)中明顯不同。

黏液細(xì)胞普遍存在于水產(chǎn)動(dòng)物的組織器官中。魚(yú)類(lèi)中的黏液細(xì)胞主要分布在皮膚、鰓及消化道的上皮中。魚(yú)類(lèi)腸道組織中普遍存在多種類(lèi)型的黏液細(xì)胞，它們?cè)诖龠M(jìn)消化、維持酸堿平衡與保護(hù)黏膜等方面發(fā)揮功能。在黃唇魚(yú)Bahabaflavolabiata[9]腸道組織中存在Ⅰ型和Ⅱ型黏液細(xì)胞；在半滑舌鰨[7]、錦鯉[8]、卵形鯧鲹Trachinotusovatus[10]腸道組織中，均觀察到Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型3種黏液細(xì)胞。由于魚(yú)的種類(lèi)不同，其食性、生態(tài)位特性、營(yíng)養(yǎng)需求具有差異，所以腸道組織中黏液細(xì)胞的類(lèi)型、數(shù)量和分布特點(diǎn)在不同魚(yú)類(lèi)中差異也較大。

建鯉Cyprinuscarpiovar. Jian具有生長(zhǎng)速度快、抗病能力強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美等特點(diǎn)，已成為鯉養(yǎng)殖的重要優(yōu)良品種。目前，對(duì)建鯉的生長(zhǎng)特性[11]、營(yíng)養(yǎng)需求[12]、養(yǎng)殖模式及技術(shù)[13]等方面已開(kāi)展了廣泛研究，但對(duì)建鯉腸道組織中胞內(nèi)酶和黏液細(xì)胞的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，首次利用組織化學(xué)染色、光密度定量分析技術(shù)對(duì)建鯉腸道中胞內(nèi)酶和黏液細(xì)胞的分布與組織定位進(jìn)行了研究，旨在為進(jìn)一步深入研究建鯉腸道生理功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用建鯉購(gòu)自天津市某養(yǎng)殖場(chǎng)，體質(zhì)量為(150 ± 30)g，體長(zhǎng)為(18 ± 1)cm。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集與處理 用MS-222將建鯉麻醉后解剖，參照Sun等[8]的方法將腸道分為前、中、后3個(gè)腸段，每個(gè)腸段分別用解剖刀平均分割為4部分。第一部分在冰凍切片機(jī)(Thermo Microm HM 525，MA，USA)上冷凍15 min后使用OCT(optimal cutting temperature compound)包埋，用于ACP組織化學(xué)染色；第二部分在質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%的甲醛鈣(4 ℃)中固定24 h，用于ALP和NSE染色；第三部分在體積分?jǐn)?shù)25%的戊二醛中固定30 min后，使用OCT包埋，用于POD染色；第四部分在波恩氏液固定8 h，石蠟包埋機(jī)包埋，用阿爾辛藍(lán)過(guò)碘酸雪夫法(AB-PAS)染色。

所用陰性對(duì)照的組織切片進(jìn)行孵育時(shí)，反應(yīng)液中不加入酶的底物。每個(gè)腸段組織選3張切片，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)視野進(jìn)行觀察、成像。

1.2.2 酶組織化學(xué) 參照Gomori[14]的方法進(jìn)行ACP染色。切片于37 ℃孵育液中保持60 min，其中孵育液中含有10 mL醋酸緩沖液(0.05 mol/L，pH 5)、10 mg硝酸鉛、0.8 g蔗糖、1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的β-甘油磷酸鈉。孵育完成后用蒸餾水清洗切片，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的硫化銨復(fù)染1 min，再次洗滌，用乙醇脫水，經(jīng)二甲苯透明后封片拍照。

采用NBT/BCIP法測(cè)定ALP活性。將組織切片在室溫下置于含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的硝基藍(lán)四唑(NBT)、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽(BCIP)、10 mL ALP緩沖液(100 mmol/L NaCl，5 mmol/L MgCl2，100 mmol/L Tris-HCl，pH 9.5)的混合液中孵育20 min。然后用蒸餾水洗滌切片，乙醇脫水，經(jīng)二甲苯透明后封片拍照觀察。

采用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)法測(cè)定POD活性。將切片置于含10 mg DAB·4HCl、5 mL蒸餾水、5 mL磷酸緩沖液(0.2 mol/L，pH 7.0)的孵育液中孵育20 min。然后將100 μL的H2O2加入溶液中，在室溫下孵育30 min。用亞甲基藍(lán)染色，蒸餾水洗滌，乙醇脫水，經(jīng)二甲苯透明后封片觀察。

采用萘酚AS鹽法測(cè)定NSE活性[15]。將切片置于含0.1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的萘酚AS乙酸鹽、10 mL磷酸緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.0)、30 mg固紅TR鹽的溶液中孵育30 min，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的甲基綠染色，蒸餾水洗滌，再用甘油明膠封片拍照。

1.2.3 AB-PAS染色 將組織切片用AB-pH 2.5-PAS染色試劑盒(Solarbio，北京)染色，乙醇脫水，經(jīng)二甲苯透明后封片觀察。每個(gè)腸段組織選3張切片，每張切片取10個(gè)視野拍照用于數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 光密度定量 使用正置熒光顯微鏡(Leica DM 4000B)進(jìn)行鏡檢拍照。利用Image圖像分析軟件，對(duì)酶組織化學(xué)染色陽(yáng)性部位進(jìn)行測(cè)定和光密度分析，計(jì)算平均光密度(ODM)，ODM值越高，代表酶活性越強(qiáng)。在400倍鏡下計(jì)數(shù)不同類(lèi)型的黏液細(xì)胞數(shù)量，并計(jì)算其占相同部位數(shù)量的百分比。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差(mean ± S.D.)表示，采用SPSS 22軟件進(jìn)行單因子方差分析(One-way ANOVA)，用Duncan法進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶組織化學(xué)染色

ACP組織化學(xué)陽(yáng)性反應(yīng)呈棕褐色(圖1A～C)，廣泛分布于整個(gè)腸道組織；ACP活性位于前腸(圖1A)和后腸(圖1C)的腸道上皮細(xì)胞核上區(qū)，在中腸(圖1B)中，主要位于腸道上皮細(xì)胞的核上區(qū)和固有層。中腸ACP活性顯著高于前腸和后腸(P<0.05)，但前、后腸間無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)。

ALP的活性部位染色結(jié)果呈藍(lán)紫色，主要分布于整個(gè)腸道上皮的紋狀緣、肌層和肌層與黏膜下層的交界處(圖2A～C)；ALP活性位于中腸(圖2B)的柱狀上皮細(xì)胞，在前腸(圖2A)和后腸(圖2C)的黏膜固有層中檢測(cè)到少量ALP分布。中腸ALP活性最高(P<0.05)，前腸和后腸ALP活性較低，且兩者之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)。

POD的活性反應(yīng)部位呈茶褐色，根據(jù)染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)腸道黏膜固有層和黏膜肌層中均檢測(cè)到POD活性(圖3A～C)。后腸POD活性最高(P<0.05)，中腸和前腸POD活性較低，且兩者之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)(表1)。

A—前腸；B—中腸；C—后腸；箭頭示POD活性部位。LP—固有層；MM—黏膜肌層。

NSE組織化學(xué)染色陽(yáng)性反應(yīng)呈紫紅色，分布于整個(gè)腸道組織，尤其在上皮細(xì)胞陽(yáng)性反應(yīng)更加明顯(圖4A～C)。光密度定量分析結(jié)果顯示，NSE活性在后腸中最強(qiáng)，在中腸次之，在前腸中最弱，且3個(gè)腸段之間具有顯著性差異(P<0.05)(表1)。

表1 建鯉腸道中4種酶活性(ODM)的分布

2.2 AB-PAS染色

AB-PAS染色結(jié)果顯示：建鯉腸道中分布3種類(lèi)型黏液細(xì)胞，這些黏液細(xì)胞均呈橢圓形，散布在整個(gè)腸道的上皮細(xì)胞和固有層中(圖5A～C)；Ⅰ型黏液細(xì)胞呈藍(lán)紫色，Ⅱ型黏液細(xì)胞呈紫紅色，Ⅲ型黏液細(xì)胞呈深藍(lán)色(圖5D～F)。建鯉腸道中3種不同類(lèi)型黏液細(xì)胞的分布數(shù)量占比見(jiàn)表2，Ⅰ型黏液細(xì)胞在前腸中數(shù)量最多(P<0.05)，后腸中最少，且中、后腸間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；Ⅱ型黏液細(xì)胞在中腸中數(shù)量最多(P<0.05)，在前腸中最少；Ⅲ型黏液細(xì)胞數(shù)量在前腸中最多，在中腸中最少，且前腸與中腸之間具有顯著性差異(P<0.05)。此外，前腸中Ⅰ型黏液細(xì)胞數(shù)量最多，Ⅲ型黏液細(xì)胞次之，Ⅱ型黏液細(xì)胞最少，且3種類(lèi)型的黏液細(xì)胞數(shù)量存在顯著性差異(P<0.05)；中腸中Ⅰ型黏液細(xì)胞數(shù)量最多，Ⅱ型黏液細(xì)胞次之，Ⅲ型黏液細(xì)胞最少，且3種類(lèi)型的黏液細(xì)胞數(shù)量存在顯著性差異(P<0.05)；后腸中Ⅰ型黏液細(xì)胞數(shù)量最多(P<0.05)，Ⅱ型和Ⅲ型黏液細(xì)胞較少。

表2 建鯉腸道不同類(lèi)型黏液細(xì)胞數(shù)量占比

在前腸(A)、中腸(B)、后腸(C)中黏液細(xì)胞廣泛分布,箭頭示各種黏液細(xì)胞;D為前腸中3種黏液細(xì)胞(a—Ⅰ型黏液細(xì)胞，b—Ⅱ型黏液細(xì)胞，c—Ⅲ型黏液細(xì)胞)；E為中腸中3種黏液細(xì)胞(a—Ⅰ型黏液細(xì)胞，b—Ⅱ型黏液細(xì)胞，c—Ⅲ型黏液細(xì)胞)；F為后腸中3種黏液細(xì)胞(a—Ⅰ型黏液細(xì)胞，b—Ⅱ型黏液細(xì)胞，c—Ⅲ型黏液細(xì)胞)。LP—固有層；EP—上皮細(xì)胞；MM—黏膜肌層。

3 討論

本研究中首次觀察了建鯉腸道內(nèi)ACP、ALP、POD、NSE的組織分布及黏液細(xì)胞類(lèi)型，建鯉腸道中普遍存在這4種胞內(nèi)酶和3種類(lèi)型的黏液細(xì)胞，但不同部位的酶活性與黏液細(xì)胞數(shù)量存在差異。

3.1 4種胞內(nèi)酶在不同腸段中的分布

ACP是溶酶體的一種標(biāo)志酶，在體內(nèi)直接參與磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移與代謝。腸道中ACP在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，特別是其可以通過(guò)催化磷蛋白的水解，廣泛參與蛋白質(zhì)胞內(nèi)消化和胞飲作用的過(guò)程[16-17]。本研究中，ACP在腸道上皮細(xì)胞核上區(qū)和固有層中廣泛分布，這與在錦鯉[8]、褐菖鲉Sebastiscusmarmoratus[18]及歐洲鰻鱺Anguillaanguilla[19]中觀察到的結(jié)果相似；而且建鯉中腸中ACP活性顯著高于前腸和后腸，推測(cè)其中腸部位具有較強(qiáng)的蛋白質(zhì)消化吸收功能。

ALP是一種在動(dòng)物體內(nèi)廣泛分布的非特異性磷酸水解酶，通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸方式參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收。腸道中ALP活性與脂類(lèi)的吸收能力存在正相關(guān)關(guān)系，一般可把ALP作為脂類(lèi)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的標(biāo)志酶[20]。本研究中，在整個(gè)腸道上皮紋狀緣與中腸的柱狀上皮中發(fā)現(xiàn)大量ALP活性，這與對(duì)歐洲鰻鱺[19]、團(tuán)頭魴Megalobramaamblycephala[21]和無(wú)須鱈Merlucciusmerluccius[22]的研究結(jié)果一致，表明這些部位具有較強(qiáng)的脂類(lèi)吸收功能。此外，在肌層和肌層與黏膜下層的交界處也發(fā)現(xiàn)大量ALP活性，這一結(jié)果可能與ALP參與物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸有關(guān)[23-24]。ALP活性在建鯉中腸中最高，而在半滑舌鰨[7]前腸中卻最高，這種結(jié)果的不同可能與不同食性魚(yú)類(lèi)腸道不同部位功能分化差異有關(guān)。

POD是一種具有免疫防御功能的氧化還原酶，其可以催化細(xì)胞內(nèi)有害物質(zhì)與H2O2反應(yīng)，生成無(wú)害的小分子氧化酚類(lèi)和胺類(lèi)等物質(zhì)，發(fā)揮殺傷病原微生物的作用，同時(shí)降低細(xì)胞內(nèi)H2O2和有機(jī)過(guò)氧化物的水平，起到保護(hù)宿主細(xì)胞的作用[22,25]。本研究中，POD活性廣泛存在于整個(gè)腸道黏膜的固有層和黏膜肌層中，這與在錦鯉[8]中觀察到的結(jié)果一致。POD活性在建鯉的后腸中最高，推測(cè)這與魚(yú)類(lèi)后腸承擔(dān)較為重要的免疫防御功能有關(guān)。

NSE是參與脂類(lèi)物質(zhì)代謝并促進(jìn)其消化吸收的一種水解酶[2,15]。本研究中，NSE分布于建鯉整個(gè)腸道組織的上皮細(xì)胞，表明這些細(xì)胞與魚(yú)類(lèi)脂類(lèi)物質(zhì)的代謝關(guān)系密切[20]。此外，在建鯉腸道中，NSE活性在后腸中最高，其次是中腸和前腸，這與在雜食性魚(yú)類(lèi)如錦鯉[8]、無(wú)須鱈[22]中觀察到的結(jié)果一致。由此推測(cè)，NSE在腸道組織中的這一分布特點(diǎn)可能在雜食性魚(yú)類(lèi)中普遍存在。

3.2 黏液細(xì)胞在不同腸段中的分布

黏液細(xì)胞依據(jù)著色差異及細(xì)胞形態(tài)被分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3種類(lèi)型。Ⅰ型黏液細(xì)胞對(duì)AB和PAS呈陽(yáng)性反應(yīng)，表明其存在中性黏蛋白和酸性黏蛋白。Ⅱ型黏液細(xì)胞只對(duì)PAS呈陽(yáng)性反應(yīng)，表明其存在糖原、中性黏蛋白和糖蛋白。Ⅲ型黏液細(xì)胞只對(duì)AB呈陽(yáng)性反應(yīng)，表明其存在硫黏蛋白、唾液黏蛋白、蛋白多糖和透明質(zhì)酸。本研究中，這3種黏液細(xì)胞散布于建鯉整個(gè)腸道的上皮細(xì)胞與固有層中，這與在大多數(shù)魚(yú)類(lèi)如錦鯉[8]、歐洲鰻鱺[26]、歐鲇Silurusglanis[27]中觀察到的結(jié)果一致。

酸性黏液物質(zhì)具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)與潤(rùn)滑消化道的功能，并維持消化道一定的酸性環(huán)境；中性黏液物質(zhì)主要起保護(hù)消化道上皮作用。本研究中，Ⅰ型和Ⅲ型黏液細(xì)胞在前腸中顯著多于Ⅱ型細(xì)胞，表明前腸中酸性黏液物質(zhì)分泌較多，這有助于魚(yú)類(lèi)前腸高效地執(zhí)行其消化功能。建鯉中腸中黏液細(xì)胞分布情況與對(duì)黃姑魚(yú)Nibeaalbiflora[28]的研究結(jié)果一致，均分布有豐富的Ⅰ型和Ⅱ型黏液細(xì)胞，故推測(cè)建鯉中腸中含有豐富中性黏蛋白和少量酸性黏多糖。這說(shuō)明消化吸收功能在建鯉前腸和中腸產(chǎn)生分化，少量酸性黏多糖和大量中性黏蛋白可能預(yù)示著中腸的消化作用減弱，而吸收功能增強(qiáng)。后腸內(nèi)黏液細(xì)胞數(shù)量最少，主要含Ⅰ型黏液細(xì)胞。魚(yú)類(lèi)后腸容易受到細(xì)菌和其他病原體感染，推測(cè)建鯉后腸酸性黏液物質(zhì)和中性黏液物質(zhì)共同參與免疫防御作用。

4 結(jié)論

1)ACP、ALP、POD、NSE 4種胞內(nèi)酶在建鯉腸道組織中廣泛存在，但腸道不同部位的酶活性強(qiáng)弱及分布具有不同特點(diǎn)。

2)在建鯉腸道組織中觀察到3種類(lèi)型的黏液細(xì)胞(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型)，主要散布于整個(gè)腸道的上皮細(xì)胞與固有層中，其數(shù)量和相對(duì)豐度在不同腸段中具有明顯差異。

3)4種胞內(nèi)酶和黏液細(xì)胞在建鯉腸道組織中的分布特點(diǎn)與其腸道的生理功能分化密切相關(guān)。