波紋龍蝦性腺抑制激素(GIH)基因克隆、表達(dá)及其對(duì)光周期的響應(yīng)

羅嘉俊，卓宏標(biāo)，陳俊濤，梁華芳，溫崇慶

(廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088)

高血糖激素家族(CHH家族)，又稱為CHH/MIH/GIH肽家族，是X器官-竇腺(X organ-sinus gland，XO-SG)中最豐富的一類肽激素，具有熱穩(wěn)定性，在調(diào)節(jié)血糖水平及調(diào)控生殖、發(fā)育和蛻皮等生理活動(dòng)中起著關(guān)鍵作用[1]。性腺抑制激素(gonad-inhibiting hormone，GIH)又稱為卵黃生成抑制激素(vitellogenesis-inhibiting hormone, VIH)，是CHH家族中重要的一員，屬于Ⅱ型肽激素，由72～87個(gè)氨基酸構(gòu)成，具有酸性等電點(diǎn)、熱穩(wěn)定性等特點(diǎn)，相對(duì)分子質(zhì)量為3 000～11 000[2-3]。該激素由眼柄中X器官的神經(jīng)分泌細(xì)胞分泌，經(jīng)軸突神經(jīng)束運(yùn)送到竇腺暫時(shí)儲(chǔ)存，之后進(jìn)入血液循環(huán)，最終作用在肝胰腺、卵巢、大顎器和雄性的促雄性腺等組織。其既無種類特異性，也無性別特異性，具有抑制卵巢發(fā)育、雄性精巢發(fā)育與交配行為、大顎器官合成甲基法尼脂(MF，保幼激素類似物)及肝胰腺合成卵黃蛋白等作用[2]。目前，關(guān)于GIH基因在斑節(jié)對(duì)蝦Penaeusmonodon、日本沼蝦Macrobrachiumnipponensis、挪威海螯蝦Nephropsnorvegicus、歐洲螯龍蝦Homarusgammarus等甲殼動(dòng)物中的研究已經(jīng)取得了不少進(jìn)展。此外，有關(guān)光周期對(duì)龍蝦性腺發(fā)育的影響也有一些報(bào)道，如Sachlikidis等[4]研究發(fā)現(xiàn)，錦繡龍蝦Panulirusornatus在夏季自然光周期條件下比冬季抱卵個(gè)數(shù)多，研究者認(rèn)為光周期是龍蝦性腺成熟和交配活動(dòng)開始的主要因素。然而，有關(guān)波紋龍蝦的相關(guān)研究報(bào)道則較少。

波紋龍蝦Panulirushomarus隸屬于十足目Decapoda腹胚亞目Pleocyemata龍蝦科Palinuroidea龍蝦屬Panulirus，是中國東南沿海的地方經(jīng)濟(jì)種類[5-6]，是中國兩大主要龍蝦養(yǎng)殖品種之一，同時(shí)也是世界龍蝦養(yǎng)殖的主要品種。波紋龍蝦具有生長快、個(gè)體大、抗病力強(qiáng)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)[5]。目前，中國海區(qū)龍蝦資源缺乏，超過80%的龍蝦需要從國外進(jìn)口。雖然各地水產(chǎn)部門對(duì)開展龍蝦人工養(yǎng)殖高度重視，但以捕撈天然龍蝦苗種進(jìn)行人工養(yǎng)殖的模式已無法滿足市場的長期需求[6-7]。因此，開展龍蝦人工繁殖研究勢(shì)在必行。目前，有關(guān)龍蝦繁殖研究主要集中在營養(yǎng)[8]、內(nèi)分泌[9]和生態(tài)環(huán)境[10-11]等領(lǐng)域，對(duì)其分子生物學(xué)方面的研究較少。本研究中，利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)(rapid amplification of cDNA ends，RACE)，基于廣東海洋大學(xué)甲殼動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供的波紋龍蝦眼柄轉(zhuǎn)錄組篩選克隆得到了PhGIH基因的全長cDNA序列，并進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)方法檢測(cè)了該基因在波紋龍蝦不同卵巢時(shí)期和不同組織的表達(dá)情況，并通過為期92 d的光周期試驗(yàn)，研究了不同光周期對(duì)波紋龍蝦卵巢發(fā)育的影響，利用qPCR檢測(cè)眼柄PhGIH基因的表達(dá)情況，以期為該基因參與波紋龍蝦性腺發(fā)育調(diào)控機(jī)制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)也為龍蝦的人工繁殖和甲殼動(dòng)物CHH家族的研究提供新的材料。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用波紋龍蝦捕自中國海南省瓊海市南海海區(qū)。選取體格均一、附肢完整、健康鮮活的波紋龍蝦，在廣東海洋大學(xué)東海島生物研究基地暫養(yǎng)一段時(shí)間后用于試驗(yàn)。于2019年8月2日選取增殖期、發(fā)育期和成熟期3個(gè)不同卵巢發(fā)育時(shí)期的波紋龍蝦在廣東海洋大學(xué)甲殼動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行GIH基因(記為PhGIH)的克隆和時(shí)空表達(dá)分析。其中，波紋龍蝦卵巢的發(fā)育階段通過其卵巢色、形態(tài)、性腺發(fā)育指數(shù)(gonadosomatic index，GSI)和組織學(xué)特性[12-13]進(jìn)行分期。

于2020年6月8日選取卵巢發(fā)育時(shí)期為增殖期、平均體質(zhì)量為123.5 g 的波紋龍蝦在廣東海洋大學(xué)東海島生物研究基地進(jìn)行光周期試驗(yàn)。試驗(yàn)期間，波紋龍蝦投喂近江牡蠣Crassostrearivulari和波紋巴非蛤Paphiaundulate。

基因克隆及組織表達(dá)試驗(yàn)選取眼柄、心臟、腦、肝胰腺、卵巢、腸、鰓等組織樣品；光周期響應(yīng)試驗(yàn)選取眼柄組織用于基因檢測(cè)，卵巢組織經(jīng)體積分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛固定后用于石蠟組織切片觀察。將波紋龍蝦解剖后，用于基因克隆及檢測(cè)的組織樣品裝入有RNA later試劑(Thermo Scientific)的凍存管中，之后放置于4 ℃過夜，再轉(zhuǎn)移至-80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑盒：SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒，購自生工生物工程(上海)股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix)、實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒(PerfectStart Green qPCR SuperMix)、TransZol Up Plus RNA Kit和DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pMD-19T載體試劑盒和SMARTer?RACE試劑盒，購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 應(yīng)用Primer 5.0軟件，根據(jù)波紋龍蝦眼柄轉(zhuǎn)錄組篩選得到的一條與短溝對(duì)蝦PenaeussemisulcatusGIH基因高度同源的1 182 bp的EST序列，設(shè)計(jì)該基因片段序列克隆引物和RACE特異性引物。根據(jù)PhGIH開放閱讀框(open reading frame, ORF)片段和眼斑龍蝦β-actin序列(GenBank登錄號(hào):GQ865599.1)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)引物。所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，各引物及其序列如表1所示。

表1 試驗(yàn)用引物及序列

1.2.2 總RNA提取及cDNA的制備 采用TransZol Up Plus RNA Kit提取上述樣品的總RNA，用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，經(jīng)Nanodrop 2000超微量核酸測(cè)定儀(Thermo Scientific)檢測(cè)其濃度和純度。將上述樣品所得總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所得cDNA用于后續(xù)的qPCR模板，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將眼柄總RNA分別按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒與SMARTer?RACE試劑盒說明書制備得到用于片段序列克隆的模板cDNA和RACE的模板cDNA。

1.2.3PhGIH基因的全長cDNA克隆 將用于片段序列克隆的眼柄cDNA作為模板，利用引物GIH-F/R(表1)進(jìn)行PCR技術(shù)擴(kuò)增，得到包含該基因ORF的中間片段序列。以該中間片段序列為模板，設(shè)計(jì)5′RACE和3′RACE的特異性引物和巢式引物。將用于RACE的眼柄cDNA作為模板，通過RACE技術(shù)和巢式PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的3′末端。第一輪PCR引物使用GIH-3′-outer(表1)和接頭通用引物UPM。反應(yīng)條件：98 ℃下循環(huán)變性10 s，59.1 ℃下退火復(fù)性5 s，72 ℃下延伸5 s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃下再延伸5 min。取PCR產(chǎn)物0.5 μL進(jìn)行巢式PCR，引物使用GIH-3′-inner(表1)和接頭通用引物NUP。反應(yīng)條件：95 ℃下預(yù)變性5 min；95 ℃下循環(huán)變性30 s，58.3 ℃下退火復(fù)性30 s，72 ℃下延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃下再延伸10 min。目的基因的5′末端擴(kuò)增與上述方法一致。

用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。切膠回收目的條帶后與pMD-19T載體4 ℃下連接過夜，然后轉(zhuǎn)化至DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的菌液均勻涂布于含氨芐的固體培養(yǎng)基上，并倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培育12 h。之后篩選陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4PhGIH序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

利用DNAMAN軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果序列進(jìn)行拼接，獲得PhGIH基因的全長cDNA序列。通過NCBI網(wǎng)站查找ORF序列，將預(yù)測(cè)的氨基酸序列與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性比對(duì)分析；利用ExPASy ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)和ExPASy ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和親水性；利用PSORT Ⅱ Prediction(http://psort.hgc.jp/form2.html)預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位；利用SignalP 5.0 軟件Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽；利用TMHMM Server 2.0軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域分析；利用SMART 4.0軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析；利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析；利用SWISS-MOLDEL(http://www.swissmodel. expasy.org/)預(yù)測(cè)三級(jí)結(jié)構(gòu)；運(yùn)用ClustalX 1.83和ClustalW 2.1軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)；使用MEGA 5.0軟件，基于N-J(Neighbor-joining)法采用Bootstrap method重復(fù)計(jì)算1 000次構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.5PhGIH基因在波紋龍蝦中的時(shí)空表達(dá)分析根據(jù)克隆得到的PhGIHORF序列設(shè)計(jì)其特異性qPCR引物GIH-qPCR-F/R和內(nèi)參基因β-actin引物β-actin-F/R(表1)。在Roche light CyclerTM96 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 儀(Roche)上進(jìn)行 qPCR 分析，檢測(cè)GIH在波紋龍蝦不同卵巢發(fā)育時(shí)期、不同組織中的表達(dá)情況。以獲得的波紋龍蝦各組織樣品cDNA作為qPCR模板，參照實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒說明書進(jìn)行PCR。qPCR反應(yīng)體系(10 μL)：上、下游引物各0.4 μL，Nuclease-free water 3.7 μL，cDNA模板0.5 μL，2×PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix 5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃下預(yù)變性30 s；95 ℃下循環(huán)變性5 s，60 ℃下退火復(fù)性15 s，72 ℃下延伸10 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.2.6 光周期對(duì)波紋龍蝦性腺發(fā)育和PhGIH基因表達(dá)的影響 波紋龍蝦在南海中國近海繁殖期為4—9月[12]，期間光周期變化為12L∶12D～13.25L∶10.75D。根據(jù)Matsuda等[10]研究發(fā)現(xiàn),日本龍蝦Panulirusjaponicus在14L∶10D時(shí)卵巢發(fā)育速度最快，因此，結(jié)合中國本土光周期變化情況設(shè)置3個(gè)光周期試驗(yàn)組，分別為12L∶12D、13L∶11D和14L∶10D。以80 W節(jié)能燈作為發(fā)光源，通過數(shù)位式照度計(jì)(TES-1330A)檢測(cè)水面的光照度為3 350 lx。用黑色遮陽布隔絕外界陽光的干擾，通過電源計(jì)時(shí)器控制開關(guān)燈時(shí)間，3個(gè)光周期試驗(yàn)組均從每日6：00開始光照。

選取23尾雌蝦和6尾雄蝦進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)期間水溫為29～32 ℃，鹽度為30。2020年6月8日，試驗(yàn)開始前隨機(jī)抽取5尾雌蝦解剖觀察其卵巢發(fā)育情況，再將剩余雌蝦隨機(jī)分到3個(gè)試驗(yàn)組中。Matsuda等[10]試驗(yàn)證明，當(dāng)日本龍蝦雌雄比例為10∶3時(shí)，所有的雌蝦均能成功產(chǎn)卵，因此，以6尾雌蝦和2尾雄蝦為一組，分別置于3個(gè)水深為0.5 m、體積為1 m3的無毒聚乙烯塑料桶中，每個(gè)桶均放置人工掩體。試驗(yàn)過程中記錄龍蝦的蛻殼、體質(zhì)量、頭胸甲長等變化情況。試驗(yàn)開始后分別在27、92 d時(shí)進(jìn)行取樣，記錄頭胸甲長、蛻殼時(shí)期、卵巢與輸卵管的質(zhì)量、顏色與形態(tài)，取少量卵巢進(jìn)行石蠟組織切片，取眼柄進(jìn)行qPCR分析，其分析方法與“1.2.5節(jié)”方法一致。

1.2.7 指標(biāo)的測(cè)定與計(jì)算 光周期試驗(yàn)中，在解剖龍蝦前通過游標(biāo)卡尺記錄其頭胸甲長，切除卵巢和輸卵管后在精密電子天平測(cè)量其濕質(zhì)量。性腺發(fā)育指數(shù)(GSI)計(jì)算公式為

GSI=m×105/L3。

其中：m為卵巢濕質(zhì)量(g)；L為頭胸甲長度(mm)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR數(shù)據(jù)運(yùn)用2-△△Ct法計(jì)算PhGIH的相對(duì)表達(dá)量。每個(gè)樣品進(jìn)行3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 SPSS 23統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-way ANOVA)，采用新復(fù)極差法(SSR)進(jìn)行組間多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 PhGIH基因的克隆及全長cDNA序列分析

利用RACE技術(shù)克隆得到的PhGIH基因(GenBank登錄號(hào)：MN864537)cDNA序列全長為1 206 bp(圖1)，包含223 bp 的5′-UTR和629 bp 的3′-UTR，ORF長度為354 bp，可編碼117個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為13 400，理論等電點(diǎn)為6.22，酸性氨基酸(Asp+Glu)和堿性氨基酸(Arg+Lys)均有13個(gè)，不穩(wěn)定系數(shù)為40.29，脂肪族氨基酸指數(shù)為83.33，具有疏水性。主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)(44.44%)，該蛋白質(zhì)含有一個(gè)信號(hào)肽，其信號(hào)肽切割位點(diǎn)位于A39與R40之間，在21～43 aa存在一個(gè)跨膜區(qū)，在48～114 aa有一個(gè)Pfam蛋白質(zhì)家族功能結(jié)構(gòu)域。

下劃線表示起始密碼子(ATG)、終止密碼子(TAA)；陰影區(qū)域?yàn)樾盘?hào)肽；方框部分為Pfam結(jié)構(gòu)域；黑色方框?yàn)楸Ｊ氐陌腚装彼釟埢徊ɡ司€表示α螺旋；斜體部分為Ploy(A)結(jié)構(gòu)。

2.2 PhGIH蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

PhGIH蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明，其由57個(gè)α-螺旋、39個(gè)無規(guī)則卷曲、16個(gè)延伸鏈和5個(gè)β-折疊組成，分別占總結(jié)構(gòu)的48.72%、33.33%、13.68%和4.27%。

通過SWISS-MOLDEL軟件以同源建模方法，構(gòu)建了波紋龍蝦GIH的三維結(jié)構(gòu)模型(圖2)，其中，包含5個(gè)α-螺旋，以及由6個(gè)保守的半胱氨酸殘基形成的3個(gè)二硫鍵錨定(圖1和圖3)。

圖2 PhGIH蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模型

2.3 PhGIH氨基酸序列同源性比較及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

將PhGIH氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與NCBI數(shù)據(jù)庫中已公布的其他物種的GIH/MIH氨基酸序列同源性不高。利用ClustalX軟件將PhGIH氨基酸序列與羅氏沼蝦Macrobrachiumrosenbergii、日本沼蝦、克氏原螯蝦Procambarusclarkii、挪威海螯蝦、歐洲螯龍蝦、短溝對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦Penaeusmonodon、非洲龍蝦Jasuslalandii、南美白對(duì)蝦Penaeusvannamei和日本對(duì)蝦Penaeusjaponicus進(jìn)行多重序列比對(duì)，結(jié)果顯示，PhGIH氨基酸序列與其他物種相似度不高，僅有部分氨基酸殘基和功能位點(diǎn)保守，其中,各氨基酸序列成熟肽有6個(gè)保守位置的半胱氨酸殘基(圖3)。利用ClustalW將上述氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，PhGIH氨基酸序列與非洲龍蝦的一致性最高(56.8%)(圖3)。利用MEGA 5.0軟件構(gòu)建PhGIH和其他物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖4)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，波紋龍蝦的分支較其他物種短，與南美白對(duì)蝦、短溝對(duì)蝦、斑節(jié)對(duì)蝦和非洲龍蝦同位于第一大支，其中與非洲龍蝦聚為一支，bootstrap值為61，親緣關(guān)系最近。

深灰色標(biāo)記保守的氨基酸殘基，淺灰色標(biāo)記相似的氨基酸殘基；下劃線為5個(gè)α-螺旋序列。

圖4 基于N-J法構(gòu)建的PhGIH氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 不同卵巢發(fā)育時(shí)期PhGIH的組織表達(dá)分析

利用qPCR技術(shù)檢測(cè)了GIH在波紋龍蝦不同卵巢發(fā)育時(shí)期的組織表達(dá)情況。從圖5可見：GIH在波紋龍蝦各個(gè)組織均有表達(dá)，但表達(dá)量差異較大，眼柄表達(dá)量最高，其次為腦、肝胰腺和卵巢，眼柄組織與其他組織的GIH表達(dá)水平存在極顯著性差異(P<0.01)；3個(gè)卵巢發(fā)育時(shí)期中，增殖期的眼柄GIH表達(dá)量最高(P<0.05)，隨著卵巢的發(fā)育，眼柄GIH表達(dá)量逐漸下降。

標(biāo)有不同大寫字母者表示同一組織不同卵巢發(fā)育時(shí)期有極顯著性差異(P<0.01)，標(biāo)有不同小寫字母者表示同一組織不同卵巢發(fā)育時(shí)期有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)。

2.5 不同光周期下波紋龍蝦的卵巢發(fā)育和眼柄GIH基因表達(dá)變化

光周期處理波紋龍蝦試驗(yàn)前，隨機(jī)解剖了5尾雌蝦，其性腺發(fā)育指數(shù)為0.32，卵巢顏色為白色，說明光周期試驗(yàn)中使用的雌蝦在試驗(yàn)開始時(shí)卵巢均處于增殖期。光周期處理試驗(yàn)進(jìn)行到第27、92天時(shí)，12L∶12D、13L∶11D和14L∶10D處理組的雌蝦GSI值出現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)(圖6)，其中12L∶12D和13L∶11D處理組的GSI值變化幅度相近，此時(shí)，兩組龍蝦的卵巢形態(tài)極細(xì)，顏色均為白色，其石蠟組織切片如圖7所示，卵巢主要由卵原細(xì)胞和卵黃板形成以前的卵母細(xì)胞組成，濾泡細(xì)胞較分散，呈橢圓形；在試驗(yàn)進(jìn)行到第92天時(shí)，14L∶10D處理組的GSI值達(dá)到1.27，為三者中最高，且顯著高于其他兩組(P<0.05)(圖6)，此時(shí)，該組龍蝦卵巢顏色呈橘紅色，形態(tài)肥厚，其石蠟組織切片如圖8所示，以成熟卵母細(xì)胞為主，細(xì)胞近橢圓形，圖中可見大多數(shù)細(xì)胞無細(xì)胞核，且卵徑較大。

標(biāo)有不同字母者表示同一時(shí)間不同光周期處理間有顯著性差異(P<0.05)，標(biāo)有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05)，下同。

opp—卵黃板形成前期卵母細(xì)胞；f—濾泡細(xì)胞。

n—細(xì)胞核；mo—成熟卵母細(xì)胞；yp—卵黃板。

利用qPCR技術(shù)檢測(cè)了不同光周期處理0、27、92 d時(shí)雌蝦眼柄PhGIH表達(dá)情況。從圖9可見：3個(gè)光周期處理組的PhGIH表達(dá)量隨時(shí)間變化均呈先上升后下降的趨勢(shì)，與GSI值變化趨勢(shì)相反；12L∶12D和13L∶11D處理組的PhGIH表達(dá)量變化幅度相近；第27天時(shí)，14L∶10D處理組的PhGIH表達(dá)量為3組中最高，且3組間存在顯著性差異(P<0.05)；第92天時(shí)，14L∶10D處理組為3組中最低，且與其余兩組間存在顯著性差異(P<0.05)。

圖9 不同光照周期眼柄PhGIH基因的表達(dá)量變化

3 討論

3.1 PhGIH基因的序列分析

蝦蟹類生殖發(fā)育的調(diào)控需要神經(jīng)肽、激素和神經(jīng)遞質(zhì)等多種調(diào)節(jié)因子的參與，涉及生殖細(xì)胞周期調(diào)控和卵黃發(fā)生等多種復(fù)雜有序的生物學(xué)過程[14]。性腺抑制激素是甲殼動(dòng)物重要的神經(jīng)內(nèi)分泌多肽激素之一，其能抑制雌性和雄性性腺的發(fā)育及交配行為[15-17]。本研究中，克隆獲得了PhGIH基因的全長cDNA序列1 206 bp，共編碼117個(gè)氨基酸，分析表明，PhGIH氨基酸序列由39個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽與78個(gè)氨基酸組成的成熟肽直接相連，其成熟肽包含有6個(gè)保守位置的半胱氨酸殘基(C46、C63、C66、C79、C83、C92)，這6個(gè)半胱氨酸殘基形成了3個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵(C46-C83、C63-C79、C66-C92)維持PhGIH蛋白質(zhì)分子天然構(gòu)象和穩(wěn)定性；成熟肽的第12個(gè)氨基酸為甘氨酸殘基，具有酸性等電點(diǎn)和熱穩(wěn)定性的特點(diǎn)，PhGIH前體缺少CHH前體相關(guān)肽(CPRP)。PhGIH的這些特征與眼柄Ⅱ型CHH/MIH/GIH家族神經(jīng)肽該有的大部分特征相一致。經(jīng)多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，PhGIH與其他物種同源性不高，與非洲龍蝦同源性最高，為56.8%；僅有部分氨基酸和功能位點(diǎn)保守，保守區(qū)主要集中在成熟肽；系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，PhGIH屬于第一大支，與非洲龍蝦親緣關(guān)系最近，與多重序列比對(duì)結(jié)果吻合。

3.2 不同卵巢發(fā)育時(shí)期PhGIH基因的組織表達(dá)

本研究中，對(duì)PhGIH基因在波紋龍蝦不同卵巢發(fā)育時(shí)期、不同組織的表達(dá)研究顯示，PhGIH在各組織中廣泛表達(dá)，在眼柄組織中表達(dá)量最高，腦、肝胰腺和卵巢次之。這表明，PhGIH主要在眼柄中合成分泌，且對(duì)肝胰腺和卵巢具有調(diào)控作用。其中，PhGIH基因在眼柄中不同卵巢發(fā)育時(shí)期表達(dá)量有顯著性差異(P<0.05)，且在卵巢增殖期表達(dá)量最高，表明X器官-竇腺復(fù)合體分泌大量PhGIH以抑制卵巢的發(fā)育。隨著卵巢發(fā)育越成熟，PhGIH表達(dá)量越低，說明PhGIH對(duì)卵巢的抑制作用也逐漸變小。這一結(jié)果與其他已報(bào)道的X器官-竇腺復(fù)合體分泌GIH的觀點(diǎn)一致。De Kleijn等[18]發(fā)現(xiàn)，在美洲螯龍蝦中GIH的轉(zhuǎn)錄本和循環(huán)水平在未成熟和卵黃發(fā)生前期較高，而在成熟期間較低。Kulkarni等[19]發(fā)現(xiàn)，在卵巢發(fā)育的無活性階段(Ⅰ期)和產(chǎn)后階段，卵巢抑制激素的活性非常高，而在全卵黃形成階段(Ⅳ期)，抑制活性幾乎可以忽略。De Kleijn等[20-21]通過Northern印跡技術(shù)驗(yàn)證了美洲螯龍蝦GIH前激素原的mRNA在眼柄組織有最大量的表達(dá)，且雌雄眼柄的GIH表達(dá)量相同。姜姝娜[22]通過檢測(cè)凡納濱對(duì)蝦GIH與Litβ-actin的積分吸光度比值，判定GIH基因在凡納濱對(duì)蝦眼柄中大量表達(dá)，腦中有少量表達(dá)。

3.3 光周期對(duì)波紋龍蝦卵巢發(fā)育和眼柄PhGIH基因表達(dá)的影響

Sachlikidis等[4]研究發(fā)現(xiàn)，光周期是性腺成熟和交配活動(dòng)開始的主要影響因素。Matsuda等[10]研究發(fā)現(xiàn)，光周期和溫度是控制日本龍蝦卵巢發(fā)育和產(chǎn)卵的重要因素，當(dāng)溫度為25 ℃、光周期為14L∶10D時(shí)卵巢發(fā)育速度最快，有更多的雌蝦能抱卵。本研究中，通過電源計(jì)時(shí)器控制開關(guān)燈時(shí)間，研究了不同光周期對(duì)波紋龍蝦卵巢發(fā)育的影響，在92 d的光周期處理后，僅有14L∶10D光周期處理組的大部分雌蝦性腺成熟，而12L∶12D和13L∶11D光周期處理組的雌蝦仍處于增殖期，表明波紋龍蝦卵巢發(fā)育受光周期的影響，且當(dāng)光周期為14L∶10D時(shí)卵巢發(fā)育速度最快，這與上述研究結(jié)果一致。本研究表明，不同光周期處理下眼柄PhGIH的表達(dá)量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)；當(dāng)眼柄PhGIH表達(dá)量上升時(shí)，性腺發(fā)育指數(shù)下降，當(dāng)眼柄PhGIH表達(dá)量下降時(shí)，性腺發(fā)育指數(shù)上升，說明PhGIH對(duì)波紋龍蝦卵巢發(fā)育產(chǎn)生了抑制作用。由此推測(cè)，光周期通過對(duì)X器官-竇腺復(fù)合體產(chǎn)生影響，使得PhGIH表達(dá)量有所變化，從而調(diào)控波紋龍蝦卵巢的發(fā)育。

4 結(jié)論

1) 使用RACE技術(shù)和反轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)克隆獲得了全長為1 206 bp的波紋龍蝦GIHcDNA序列，其具有CHH家族Ⅱ型肽激素的典型特征。

2) 波紋龍蝦GIH基因在各組織中廣泛表達(dá)，在眼柄中的表達(dá)量最高。

3) 波紋龍蝦GIH基因在波紋龍蝦卵巢發(fā)育至增殖期時(shí)表達(dá)量最高，隨著卵巢的發(fā)育，其表達(dá)量下降。

4) 14L∶10D光周期處理對(duì)波紋龍蝦卵巢發(fā)育的促進(jìn)作用效果最明顯。