基于高通量測序及Biolog-ECO方法的雄安新區(qū)鰣鯸淀細菌群落結構與功能多樣性分析

鄧茹，陳曦，裘麗萍，孟順龍*，陳家長*

(1.上海海洋大學 水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心，上海 201306； 2.中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子風險評估實驗室(無錫)，中國水產(chǎn)科學研究院內(nèi)陸漁業(yè)生態(tài)環(huán)境和資源重點開放實驗室，江蘇 無錫 214081)

水生生態(tài)系統(tǒng)中, 微生物群落在有機物分解和營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化中發(fā)揮著重要作用。浮游細菌和附著細菌在整個淡水生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)和能量循環(huán)中作用重要,它們在物質(zhì)能量循環(huán)中既是分解者又是生產(chǎn)者[1], 一方面，細菌可分解有機物釋放能量，以異養(yǎng)方式生長，它們扮演分解者的角色[2]；另一方面,細菌可以利用可溶性有機物質(zhì)(不能被真核藻類吸收)轉(zhuǎn)換成顆粒有機物,然后由原生動物和微型浮游動物捕食后再傳遞到后生動物構成微食物環(huán)，此時細菌成為生產(chǎn)者[3]。此外, 無論是浮游細菌還是附著細菌，它們自身的增殖也為水體中的底棲動物、浮游動物等提供了直接的營養(yǎng)來源，在食物鏈中起著重要的作用。

隨著分子生物學技術的推陳出新，方便快捷、經(jīng)濟可靠的微生物檢測技術被越來越多的研究學者所接受。高通量測序技術能夠獲得全面的微生物群落信息，且能夠更高效準確地解析微生物功能信息[4-5]，目前，該技術已在淡水生態(tài)系統(tǒng)和海洋生態(tài)系統(tǒng)中得到良好的應用[6-7]。其中，Biolog-ECO平板法通過直接在微平板上培養(yǎng)微生物群體，測定微生物對不同碳源的利用程度，實時監(jiān)測其引起的光吸收度變化，借以探究微生物的生理特征及其群落結構[8]。Biolog-ECO作為一種方便快速的微生物檢驗技術,已廣泛應用于環(huán)境微生物檢測、微生物生態(tài)研究等方面，用該方法可以獲得微生物群落碳源利用能力的大量數(shù)據(jù),從而反映微生物活性的豐富信息[9]。

濕地是自然界生物多樣性最豐富的生態(tài)系統(tǒng)之一，與社會發(fā)展和人類福祉密切相關[10]。為了更好地了解微生物群落在大型淺水湖泊中的重要性，本研究中選擇國家級新區(qū)雄安新區(qū)的水命脈——白洋淀中鰣鯸淀濕地為研究對象。目前，有關分析白洋淀細菌微生物多樣性特征，利用具有生態(tài)功能的土著微生物幫助恢復湖泊生態(tài)系統(tǒng)的研究尚少，大部分均關注湖泊藻類、浮游動物的群落結構特征[11]。針對白洋淀鰣鯸淀生態(tài)現(xiàn)狀，本課題組實施了生態(tài)修復工程，期望建設適宜微生物附著的功能載體，如棕櫚片、網(wǎng)片、人工水草，以濕地天然蘆葦基質(zhì)為對照，以期提高湖泊生態(tài)系統(tǒng)的自我凈化能力。本研究中，基于高通量測序技術對4種不同基質(zhì)附著細菌及浮游細菌群落多樣性及其群落組成和分布特征進行分析，并通過Biolog-ECO技術分析附著和浮游微生物對不同碳源的利用程度，旨在更好地了解水體浮游細菌與附著細菌在大型淺水湖泊生態(tài)系統(tǒng)中的相對重要性，為后續(xù)微生物資源的開發(fā)利用提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗樣品于2019年10月采自雄安新區(qū)白洋淀國家級水產(chǎn)種質(zhì)資源保護區(qū)鰣鯸淀(38°50′30″～38°51′0″N、115°59′20″～115°59′40″E)。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 水樣采集遵循遍布全湖的原則，共設置9個采樣點(記為E1～E9)，每個采樣點設置3次重復采樣。于水表面下0.5 m處采集水樣，采集裝置為2.5 L有機玻璃采水器和1 L無菌聚乙烯瓶，后將所采水樣于4 ℃條件下運送至實驗室。

1.2.2 樣品處理 水樣采用真空抽濾的方式過0.22 μm無菌濾膜，后將濾膜用無菌鑷子轉(zhuǎn)移至10 mL無菌離心管中，密封后于-80 ℃超低溫冰箱中冷藏，待提取DNA。附著基質(zhì)分別為棕櫚片(A)、網(wǎng)片(B)、人工水草(C)、蘆葦(D)和浮游細菌(E)，每種基質(zhì)設置3個平行。采樣時將淀內(nèi)附著基取出水面，用無菌刀片刮取附著基表面物質(zhì)，置于無菌離心管中密封后，于-80 ℃超低溫冰箱中冷藏，待提取DNA。

1.2.3 DNA提取 使用FastDNA旋轉(zhuǎn)試劑盒和FastPrep儀器(MP Biomedicals, Santa Ana,CA)從樣品中分離出DNA，DNA濃度和純度利用NanoDrop 2000進行檢測，利用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。

1.2.4 高通量測序 PCR擴增及其高通量測序采用細菌引物為338F: 5′ ACTCCTACGGGAGGCAGCAG 3′和 806R: 5′ GGACTACHVGGGTWTCTAAT 3′。隨機選取樣品進行預試驗，以確保在最低循環(huán)數(shù)中絕大多數(shù)樣品能夠擴增出濃度合適的產(chǎn)物。PCR 正式試驗采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase(TransGen AP221-02)，反應體系為20 μL。擴增程序為: 95 ℃下預變性3 min；95 ℃下變性 30 s，55 ℃下退火復性30 s，72 ℃下延伸40 s，共進行30個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸 10 min。所有樣本反應結束后，每個樣本再進行3個重復，將同一樣本的 PCR產(chǎn)物濃度進行等量混樣后使用20 g/L瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，并進行電泳檢測。利用Illumina公司的Miseq PE 300平臺進行測序，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序，對原始序列進行預處理，根據(jù)不同的相似度水平，對所有序列進行OTU劃分，通常對97%相似水平下的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析。運用Kruskal-Wallis秩和檢驗方法比較物種豐度，基于Bray-curtis距離算法對物種進行非度量多維尺度分析。

1.2.5 微生物對碳源的利用 Biolog-ECO板中平均每孔顏色變化率(average well color development，AWCD)主要是衡量微生物利用不同碳源的整體能力，亦反映微生物對31種碳源的利用能力和偏好。將適量的樣品用質(zhì)量分數(shù)0.85%的生理鹽水按一定比例進行稀釋，用8孔加樣器將150 μL稀釋后的樣品加至Biolog-ECO微平板中，置于28 ℃恒溫箱避光培養(yǎng)，采用 Beckman Beachmark plus 酶標儀，每24 h讀板1次，連續(xù)讀7次，分別讀取培養(yǎng)24、48、72、96、120、144、168 h時Blank 590和Blank 750波長的數(shù)值。選擇72 h的數(shù)據(jù)來分析不同樣品中微生物對6大類碳源利用強度的顯著性差異。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft office和SPSS 25軟件,對利用Biolog-ECO方法所得到Blank 590和Blank 750波長的數(shù)值進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 浮游細菌與附著細菌群落結構組成特征

從21個樣品中共檢測出1 204 184個有效序列，其中，包括50門127綱257目482科957屬1 844種，共計4 828 OTU。對門水平豐度求平均值，結果如圖1(a)所示，合并豐度<1%的數(shù)值共12門菌群，分別為疣微菌門Verrucomicrobia、變形菌門Proteobacteria、藍細菌門Cyanobacteria、放線菌門Actinobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、綠彎菌門Chloroflexi、浮霉菌門Planctomycetes、Saccharibacteria、厚壁菌門Firmicutes、酸桿菌門Acidobacteria、WS6和綠菌門Chlorobi。從門組成可知，附著細菌中，疣微菌門為第一優(yōu)勢菌門，變形菌門為第二優(yōu)勢菌門，之后為藍細菌門；而浮游細菌中，藍細菌門為第一優(yōu)勢菌門，放線菌門為第

圖1 門水平上相對分布及物種豐度顯著性檢驗

二優(yōu)勢菌門，之后為變形菌門。因此，浮游細菌與附著細菌在組成及豐度上存在明顯差異。

基于Kruskal-Wallis秩和檢驗方法比較物種豐度差異可知(圖1(b))，浮游細菌與附著細菌組微生物群落中物種豐度表現(xiàn)出顯著差異性，其中，浮游細菌組中疣微菌門、Saccharibacteria、厚壁菌門、TM6_Dependentiae、SR1_Absconditabacteria等物種豐度顯著低于附著細菌組(0.01

2.2 細菌群落結構的多樣性分析

通過高通量測序數(shù)據(jù)對測序結果進行比對，并對采集樣品進行α-多樣性分析，結果表明，所有樣品的覆蓋度均在99.1%以上，說明測序數(shù)據(jù)有效可靠，可以作為分析的依據(jù)。從表1可見：Sobs指數(shù)結果顯示，浮游細菌和棕櫚片的OTU數(shù)目顯著高于人工水草、蘆葦基質(zhì)和網(wǎng)片附著基質(zhì)(P<0.05)；Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)反映物種的多樣性,結果顯示，浮游細菌和棕櫚片基質(zhì)附著細菌的多樣性顯著高于網(wǎng)片基質(zhì)、人工水草和蘆葦基質(zhì)附著細菌(P<0.05)，而Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)反映物種的豐富度，結果顯示，浮游細菌和棕櫚片基質(zhì)附著細菌的豐富度顯著高于網(wǎng)片基質(zhì)、人工水草和蘆葦基質(zhì)附著細菌(P<0.05)。

表1 微生物多樣性指數(shù)分析

Beta多樣性分析是根據(jù)Bray-curtis距離算法，對物種進行非度量多維尺度(non-metric multidi-mensional scaling，NMDS)的分析(圖2)，結果表明，樣品在維度NMDS1和維度NMDS2能夠較好地被區(qū)分開，其中，Stress值為0.038，表明具有較好的代表性，能較好地證明數(shù)據(jù)的可靠性。浮游細菌僅出現(xiàn)在第一象限，能較好地與附著細菌區(qū)分開來；人工水草基質(zhì)和網(wǎng)片基質(zhì)大部分分布在第二象限，棕櫚片基質(zhì)出現(xiàn)在第二、三象限，而蘆葦基質(zhì)分布在第二、三、四象限。表明附著細菌中棕櫚片和蘆葦基質(zhì)的相似性較大，人工水草基質(zhì)與網(wǎng)片基質(zhì)相似性較大；而浮游細菌與附著細菌間的差異性最大(P=0.001)。

圖2 相似性>97%的OTU水平上非度量多維度分析

2.3 微生物對6大類碳源總體利用的影響

從圖3可見：浮游微生物及不同基質(zhì)上的附著微生物對全部碳源的利用強度均隨培養(yǎng)時間的延長而呈先增加后逐漸變緩直至停止趨勢；24 h微生物活性較低，可看出浮游微生物的活性明顯低于附著微生物的活性；48～120 h是微生物利用碳源的高峰期，平均每孔顏色變化率隨培養(yǎng)時間延長呈先增加而后趨于穩(wěn)定。從總體趨勢來看，浮游微生物的變化幅度最大，這說明對碳源利用能力最強，且顯著高于附著微生物對碳源的利用能力；不同基質(zhì)上的附著微生物平均每孔顏色變化率由大至小依次為人工水草>蘆葦>棕櫚片>網(wǎng)片基質(zhì)。表明人工水草基質(zhì)上的微生物碳源代謝強度最高，而網(wǎng)片基質(zhì)上微生物對碳源的利用能力最低。微生物群落代謝活性反映了微生物生存群落的特征，其平均每孔顏色變化率值變化趨勢的差異說明浮游微生物與附著微生物間及不同基質(zhì)上附著微生物間群落是存在明顯差異。

圖3 鰣鯸淀微生物全部碳源的利用情況

2.4 不同微生物群落對不同碳源的利用情況

為研究浮游微生物及不同附著基質(zhì)上微生物群落碳代謝的影響，選擇Biolog-ECO培養(yǎng)72 h作為分析時間點進行PCA分析，提取3個主成分，第1主成分(PC1)為41.9%，第2主成分(PC2)為25.2%，第3主成分(PC3)為9.8%，3個主成分綜合了全部31種碳源76.9%的信息，提取前2個主成分做PCA圖(圖4)，以表征各組微生物群落碳源代謝特征，2個主成分積累貢獻率達67.111%。由圖4可知，附著微生物組主要分布在第一、二象限，而浮游微生物組主要分布在第三、四象限，說明附著微生物與浮游微生物間的微生物碳代謝特征差異明顯。附著微生物組中人工水草基質(zhì)與蘆葦基質(zhì)較近，說明相似程度較高，對不同碳源的利用能力較相似；而棕櫚片及網(wǎng)片基質(zhì)與其他基質(zhì)的距離較遠，說明相似度不高，差異較明顯。

圖4 不同微生物群落的主成分分析

Biolog-ECO板中包含的31種單一碳源按照代謝特性和化學結構分為6大類：聚合糖類(7 種)、氨基酸類(6 種)、脂類(4 種)、醇類(3 種)、胺類(3種)和酸類(8種)。表2列出了31種碳源與3個主成分間的相關系數(shù)，從表中可看出，微生物代謝基質(zhì)主成分1相關系數(shù)0.55以上的基質(zhì)有24種，相關系數(shù)大于0.75的有7種，其中，酸類3種，氨基酸類2種，聚合糖類1種，酯類1種; 主成分2相關系數(shù)0.55以上的基質(zhì)有9種; 主成分3相關系數(shù)0.55以上的基質(zhì)僅有1種，說明不同試驗組微生物代謝功能群落結構的差異主要體現(xiàn)在與主成分1相關系數(shù)較高的基質(zhì)上。與主成分1相關系數(shù)在0.80以上的為α-D-乳糖、L-絲氨酸，與主成分2相關系數(shù)在0.80以上的為甘氨酰-L-谷氨酸、I-赤藻糖醇。碳源的相關性越高，表明該碳源對不同微生物組群區(qū)分的貢獻率越大，但是不能完全說明該碳源的實際利用程度也高，也有可能是不同微生物組群的碳源利用率差異性高。

表2 31種碳源與3個主成分之間的相關系數(shù)

3 討論

3.1 基于高通量測序的浮游細菌與附著細菌差異分析

本試驗結果表明，附著細菌群落中變形菌門豐度比例高于藍細菌門，而浮游細菌群落中藍細菌門豐度比例高于變形菌門，藍藻門在附著細菌群落中豐度比例明顯低于浮游細菌群落，此結果與Grossart等[12]研究海洋硅藻浮游細菌及附著細菌群落結構的結果相反。不同基質(zhì)附著微生物群落與浮游微生物群落間在優(yōu)勢微生物類群方面均有所不同，這表明特定環(huán)境可以影響微生物的組成。研究發(fā)現(xiàn)，水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的發(fā)生與環(huán)境微生物群落組成密切相關[13]，但環(huán)境因素對微生物群落和病原菌比例的影響還有待進一步研究。從鰣鯸淀細菌群落多樣性分析發(fā)現(xiàn)，其總體上呈現(xiàn)浮游細菌的豐富度和多樣性顯著高于附著細菌，這與對太湖水體附著細菌和浮游細菌的豐度與分布特征的研究結果相反，這可能與采樣時間、 采樣點位環(huán)境因子狀況有關，這也說明了不同湖區(qū)間的差異性。目前， 海洋生態(tài)系統(tǒng)中水體附著細菌的研究相對較多[14-15]，已有的研究表明，附著細菌比浮游細菌在海洋水生生態(tài)系統(tǒng)中所起的作用更為重要。Tang等[16]對太湖有機集聚體上的附著細菌種類組成進行了研究，其結果表明，有機集聚體上的附著細菌在湖泊生態(tài)系統(tǒng)微食物環(huán)中的地位較為重要。因此，如何控制環(huán)境條件形成最有益的功能微生物群落顯得尤為重要。

3.2 基于Biolog-ECO方法的不同微生物群落功能多樣性分析

Biolog-ECO 平板中的平均每孔顏色變化率值反映了微生物群落利用不同單一碳源的整體能力和偏好，在碳源種類相同的條件下，對不同微生物利用碳源情況進行比較，可以反映出不同基質(zhì)附著微生物及浮游微生物對不同類型碳源的利用強度的差異[17]。本試驗結果表明，浮游微生物的平均每孔顏色變化率值明顯高于附著微生物，說明浮游微生物的生物活性最活躍。以往的研究中，較少從碳源利用能力上比較附著微生物與浮游微生物群落結構差異，昝帥君等[18]探究了遼河口浮游細菌和附著細菌群落結構及多樣性分析，研究發(fā)現(xiàn)，相對附著細菌而言，浮游細菌在河口生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動方面發(fā)揮著更加重要的作用。因此，全面了解環(huán)境中微生物群落特征對整個生態(tài)系統(tǒng)的循環(huán)非常重要。董媛媛等[19]在養(yǎng)殖水體中添加不同濃度的光合細菌發(fā)現(xiàn)，改變浮游微生物群落結構既能增強水體微生物對碳源的整體利用能力，又能節(jié)約養(yǎng)殖成本。可見鰣鯸淀浮游微生物利用碳源能力較強，說明淀內(nèi)養(yǎng)殖環(huán)境較好，且較多的附著基質(zhì)增加了湖泊生態(tài)資源的多樣性，亦為微生物和魚類資源等提供了優(yōu)良的棲息環(huán)境。

Biolog-ECO平板法是將微生物群落功能多樣性反映在微生物對不同碳源的利用程度上，其主成分分析可以有效反映微生物群落功能結構特征[20]。本研究中綜合3個主成分結果可知，不同附著微生物與浮游微生物群落代謝功能起作用的主要碳源類型為氨基酸類、聚合糖類和醇類，不同微生物群落差異主要體現(xiàn)在對氨基酸類和聚合糖類碳源的利用上，其中以氨基酸類最為突出。有研究表明，不同碳源產(chǎn)生的胞外聚合物有較大差異[21]，且水體中的藻類在光照和二氧化碳充足的條件下，可以產(chǎn)生大量的酯類和碳氫化合物[22]，進一步影響參與微生物群落組成和微生物從不同碳源中的獲益方式[23]。由于Biolog-ECO微平板技術依舊存在著一定的局限性，僅采用此技術很難完整反映生態(tài)環(huán)境微生物群落功能多樣性的變化規(guī)律，有關不同基質(zhì)上附著微生物與浮游微生物群落功能差異等方面的研究，還需進一步探索。

3.3 不同微生物群落結構對碳源利用能力的影響

本研究中，通過高通量測序表明，浮游細菌與附著細菌存在明顯的差異，同時發(fā)現(xiàn)浮游微生物的生物活性明顯高于附著微生物，由此可見，微生物對碳源利用能力的影響因素之一是微生物群落結構間的差異。張哲等[24]研究發(fā)現(xiàn)，生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落結構隨添加碳源的不同會發(fā)生一定的變化，證明微生物群落組成與其對碳源的利用程度存在著較大的關聯(lián)。其主要原因是由于不同微生物對不同碳源的需求量不同，因而造成環(huán)境中剩余碳源的差異。微生物群落是一個龐大的群體，需通過更加深入的研究來發(fā)現(xiàn)其對碳源利用的不同機制。探明鰣鯸淀生態(tài)系統(tǒng)中微生物的碳源利用能力不僅可以深入了解生態(tài)循環(huán)過程，而且可以較好地反映出水質(zhì)綜合狀態(tài)的變化，進而提煉出更多的有用信息[25]。

4 結論

1)位于雄安新區(qū)的鰣鯸淀內(nèi)主要優(yōu)勢菌群為疣微菌門、變形菌門、藍細菌門、放線菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、浮霉菌、Saccharibacteria、厚壁菌門、酸桿菌門、WS6和綠菌門，且浮游細菌與附著細菌在組成及豐度上存在明顯差異，其中，疣微菌門是附著細菌中的第一優(yōu)勢菌門，而藍細菌門是浮游細菌中的第一優(yōu)勢菌門。

2)通過平均每孔顏色變化率值發(fā)現(xiàn)，浮游微生物的生物活性明顯高于附著微生物，且相對附著細菌而言，浮游細菌在生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動方面發(fā)揮著更加重要的作用。

3)不同附著微生物與浮游微生物群落代謝功能起作用的主要碳源類型為氨基酸類、聚合糖類和醇類，不同微生物群落差異主要體現(xiàn)在對氨基酸類和聚合糖類碳源的利用上，尤以氨基酸類最為突出。