液相色譜-串聯質譜法測定雞肉中林可霉素殘留量的不確定度評定

◎ 石雪芬，范明志，蔣 龍，石美蓮，陳金余

（深圳信測標準技術服務有限公司，廣東 深圳 518000）

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

前處理使用的試劑甲醇、乙腈、正己烷均為色譜純；氫氧化鈉、磷酸氫二鈉、無水硫酸鈉和氯化鈉為AR級別；流動相使用的試劑乙腈、甲酸銨均為質譜純；林可霉素標準物質純度93.9%，純度偏差±1.0%，生產廠家為中國食品藥品檢定研究院。

15%乙腈水溶液：150 mL甲醇與850 mL水混合；甲酸銨溶液：0.1 mmol·L-1。0.63 g甲酸銨加水溶解至1 000 mL；2%氯化鈉溶液：稱取10.0 g氯化鈉，溶解于500 mL水中；磷酸鹽緩沖溶液：0.1 mol·L-1。6.0 g磷酸氫二鈉溶解于450 mL水中，用氫氧化鈉飽和溶液調節pH=8，用水定容至500 mL，使用前配制；甲醇+水溶液（2+3）：400 mL甲醇與600 mL水混合，使用前配制。

1.2 儀器與設備

液相色譜-質譜聯用儀：Triple Quad 4500；旋轉蒸發器：北京恒奧德HAD-XZF2；萬分之一電子天平：上海精其FA2204N；水浴氮吹儀器：北京恒奧德H30102；多管渦旋混旋儀：上海精其LF-200 ；臺式離心機：凱特TD5；固相萃取裝置：北京恒奧德H27666

1.3 方法

按GB/T 20762—2006采用液相色譜-質譜/質譜法測定雞肉中林可霉素殘留量。通過對實驗過程各不確定度來源分析、計算和合成，從而評定其不確定度。

稱取5 g試樣，置于50 mL離心管中，加入20.0 mL乙腈，于振蕩器上劇烈振蕩20 min，再加入2.0 g無水硫酸鈉、1 g氯化鈉和3.0 mL正己烷，于振蕩器上劇烈振蕩10 min。以3 500 r·Lmin-1的轉速離心5 min，取乙腈于雞心瓶中，于55 ℃水浴中旋蒸至近干左右，待凈化。

用7 mL磷酸鹽緩沖溶液分兩次溶解殘液，使樣液以小于1.0 mL·min-1的流速通過Oasis HLB固相萃取柱。樣液全部流出后，再用10 mL水和5 mL甲醇十水溶液洗柱，棄去全部流出液，固相萃取柱用真空泵抽干1 h。再用10 mL甲醇洗脫于15 mL錐形試管中，用氮氣濃縮儀于55 ℃水浴中吹至近干，準確加入

1.0 mL 15%乙腈水溶液溶解殘渣。過0.2 μm濾膜后，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

2 數學模型分量的來源及分析

雞肉中林可霉素殘留量定量檢測計算公式為：

式中：X-樣品中9種大環內酯類的含量，mg·kg-1；C-根據工作曲線計算的樣品溶液的濃度，μg·mL-1；V-定容體積，mL；m-樣品質量，g；1 000-單位換算。由上述公式可見，根據不確定度的傳播定律，可得到被測樣品中被測物含量X的不確定度u(p)計算公式（2），9種大環內酯類不確定度的因果關系魚骨圖分析如圖1所示[1]。

式中：u(p)-林可霉素濃度的相對標準不確定度；u(Cstd)-林可霉素標準儲備液引入的相對標準不確定度；u(m)-樣品稱量天平和稱量重復性的不確定度；u(Vsample)-樣品提取定容引入的相對標準不確定度；u(A)-重復測定樣品引入的相對標準不確定度。

3 林可霉素的不確定度分量計算

3.1 標準溶液濃度的不確定度

3.1.1 林可霉素標準物質純度產生的相對不確定度

林可霉素93.9%，純度偏差±1.0%，生產廠家，中國食品藥品檢定研究院。按供應商目錄所給純度，假定均勻分布，林可霉素相對標準不確定度為

3.1.2 稱量標準物質時產生的相對標準不確定度稱量引入的不確定度來自兩個方面。

（1）稱量變動性，在50 g以內，變動性標準偏差為0.08 mg。

（2）用十萬分之一天平稱取10 mg標準物質于10.00 mL容量瓶中，用乙腈-水（3∶7體積比）溶液定容至刻度，此標準儲備溶液為1 mg·mL-1。天平的校準證書給出在95%置信水平時，不確定度為0.3 mg，按照正態分布考慮評定其標準不確定度。查表得，當置信水平p＝95%時，k＝1.96。林可霉素的相對標準不確定度為上述兩項合成得出稱量的標準偏差為：

3.1.3 配制儲備液時產生的相對標準不確定度

使用10.00 mL容量瓶配制1 mg·mL-1標準儲備液，其不確定度包括3個部分。

（1）由于玻璃的膨脹系數很小，因溫度引起的體積變化此處可以忽略不計。

（2）容量瓶體積的不確定度，按《實驗室玻璃儀器 單標線容量瓶》（GB/T 12806—2011）規定，A級單標線10.00 mL容量瓶的容量允許差為±0.02 mL，按均勻分布，用容量瓶配置標準儲備液的相對標準不確定度均為：

（3）充滿液體至容量瓶刻度的估讀誤差，根據經驗得估讀誤差為0.05 mL，分布考慮矩形分布，其引入的標準不確定度為：則用10.00 mL容量瓶配制1.0 mg·mL-1標準儲備液的相對標準不確定度為：

3.1.4 稀釋工作液時產生的相對標準不確定度

1 mg·mL-1標準儲備液稀釋至10 μg·mL-1的標準中間液。先用1 mL的吸量管移取1 mL的標準儲備液至100.00 mL容量瓶中，定容至刻度。用1.00 mL的吸量管移取0.10 mL的100 ng·mL-1的標準中間液至100.00 mL容量瓶中，定容至刻度。其不確定度包括2次100.00 mL容量瓶和2次1.00 mL移液管的相對不確定度。

（1）1 mL移液管容量允差參照《實驗室玻璃儀器 分度吸量管》（GB 12807—1991）規定：1.00 mL標稱容量的允許差為±0.008 mL，按均勻分布計算標準偏差為[3]：

（2）由于玻璃的膨脹系數很小，因溫度引起的體積變化此處可以忽略不計。

（3）100.00 mL容量瓶允差參照《實驗室玻璃儀器 單標線容量瓶》（GB 12806—2011）規定，100.00 mL標稱容量的允許差為±0.1 mL，按均勻分布，其引入的標準不確定度為：

（4）充滿液體至容量瓶刻度的估讀誤差，根據經驗得估讀誤差為0.05 mL，考慮矩形分布，其引入的標準不確定度為：

則用100.00 mL容量瓶配制1 mg·mL-1標準儲備液的相對標準不確定度為：

1 mg·mL-1標準儲備液稀釋至10 μg·mL-1的標準中間液，10 μg·mL-1的標準中間液稀釋至100 ng·mL-1的標準使用液的相對標準不確定度均為：

綜上所述，配制林可霉素準儲備液引入的相對標準不確定度為：

3.2 樣品稱量的不確定度

稱量雞肉樣品的質量為5.001 7 g，稱量不確定度來自兩個方面[4]。

（1）稱量變動性，在50 g以內，變動性標準偏差為0.08 mg。

（2）天平校正產生的不確定度，準證書給出的在95%置信概率時為0.3 mg，按照正態分布考慮評定其標準不確定度。查表得，當置信水平p＝95%時，k＝1.96，換算成標準偏差為0.3/1.96＝0.153 1 mg。

由上述兩項合成得出稱量的標準偏差為：

3.3 樣品定容體積的標準不確定度

樣品定容至1.0 mL容量瓶中，其不確定度包括3個部分。

（1）由于玻璃的膨脹系數很小，因溫度引起的體積變化可以忽略不計。

（2）容量瓶體積的不確定度，按《實驗室玻璃儀器 單標線容量瓶》（GB/T 12806—2011）規定，A級單標線2 mL容量瓶的容量允許差為±0.01 mL，按均勻分布，用容量瓶配置標準儲備液的相對標準不確定度均為：

（3）充滿液體至容量瓶刻度的估讀誤差，根據經驗得估讀誤差為0.01 mL，考慮矩形分布，其引入的標準不確定度為：

則用10.00 mL容量瓶配制1 mg·mL-1標準儲備液[5]的相對標準不確定度為：

3.4 重復測定的標準不確定度u(A)

重復測定6次，結果見表1，假定均勻分布，相對標準不確定度為：

表1 重復測定6次的數據結果表

4 林可霉素的合成不確定度

林可霉素的合成不確定度為：

5 林可霉素的擴展不確定度

取包含因子k=2，置信水平約為95%，則擴展不確定度為：

6 結果報告

從測量評定分析結果可看出，本方法不確定度分量最大的是樣品重復測定引入的不確定度，其次是標準溶液引入的不確定度和樣品重復性引入的不確定度。當林可霉素殘留量為2.71 μg·kg-1時，測定結果表示為（2.71±0.084）μg·kg-1，k=2。