大豆低聚糖儀器檢測方法現狀概述

◎ 劉曉丹，岳海艷，譚智峰

（上海城建職業學院 健康與社會關懷學院，上海 201415）

大豆低聚糖（Soybean Oligosaccharides，SBOS）是大豆中可溶性寡糖的總稱，主要由2～10個相同的或不同的單糖以支鏈的形式經糖苷鍵聚合而成[1]，其主要成分是蔗糖、棉子糖和水蘇糖[2]，其中蔗糖是由一分子果糖和1分子α-D-吡喃葡萄糖的半縮醛羥基和1分子β-D-呋喃果糖的半縮醛羥基脫水通過1，2-糖苷鍵結合而成；棉子糖又稱蜜三糖，由右旋半乳糖、右旋葡萄糖和左旋果糖各1分子組成的三糖，即α-D-吡喃半乳糖基-（1,6）-α-D-吡喃葡萄糖基-（1,2）-β-D-呋喃果糖苷；水蘇糖是在蔗糖分子的葡萄糖基上以α-1,6鍵連接2個半乳糖分子，D-吡喃半乳糖基通過α-1,6糖苷鍵與棉子糖的D-吡喃半乳糖基連接而成的四糖，即由2分子D-半乳糖與1分子蔗糖，通過α-1,6糖苷鍵組成的寡糖，上述3種低聚糖均屬于非還原糖。大豆低聚糖熱穩定性較好，在pH=3下也能體現良好的熱穩定性。此外，大豆低聚糖中3種主要成分為非還原糖，因此在酸性條件下不易發生美拉德反應，但在中性或堿性條件下溫度超過80 ℃時，會發生美拉德反應[3]，此外也有研究者嘗試在堿性條件下將殼聚糖與大豆分離蛋白進行美拉德反應，其褐變程度比較小，褐變程度與糖類分子鏈的長度有關[4]，因此，也可以推斷在中性或堿性條件下葡萄糖與大豆分離蛋白褐變程度大于大豆低聚糖褐變程度大于和殼聚糖褐變程度。

大豆低聚糖已公認的優點是能活化腸道內雙歧桿菌并促進其生長繁殖，抑制腸內腐敗菌的生成，能預防便秘和腹瀉，同時也不會導致齲齒等；最新研究還表明大豆低聚糖具有降血脂作用，CHEN[5]研究證明大豆低聚糖對血脂、血糖和氧化應激有顯著的降低作用，李倩倩等人[6]研究也證實了大豆低聚糖對降低血脂具有有效作用；大豆低聚糖促生長的腸道益生菌能吸收膽固醇從而有效降低人體血液中膽固醇的含量[7]；大豆低聚糖對心臟還有保護作用，研究發現在心肌缺血/再灌注過程中，大豆低聚糖預處理有可能通過激活JAK2/STAT3信號傳導通路途徑而產生心肌保護作用[8]；大豆低聚糖也被證明抗癌作用，如針對胃癌，大豆低聚糖可誘導部分胃癌細胞株BGC-823細胞凋亡[9]，此外腸道益生菌能降解致癌有害物質從而達到預防癌癥的作用。誠然，大豆低聚糖的缺點也是顯而易見，難于消化，容易形成脹氣因子導致人體不適，但總體而言，大豆低聚糖的優點大大高于缺點，成為目前食品界較為關注的益生營養成分，并且很多研究都證實了大豆低聚糖對人體的積極功效。

大豆低聚糖中的主要成分蔗糖、棉子糖和水蘇糖是極易溶于水的，因此在大豆制品生產領域，大豆低聚糖往往更多存在于生產廢水——黃漿水中。黃漿水是豆制品加工過程中產生的工業廢水，在豆腐、千張、豆干等豆制品制作過程中為了使產品固定成型，需要將多余的水和能透過包布的小顆粒及水溶物過濾排出，此過程中通過壓榨擠壓排出的乳黃色或乳白色等均勻不透明的水，稱為“黃漿水”，又叫豆清水[10]。大豆低聚糖在黃漿水中的含量相對較高，大量排放到環境中，會造成大量微生物滋生，造成腐敗導致環境污染。因此，尋找合理的提取和檢測大豆低聚糖的方法意義巨大。目前，對黃漿水中大豆低聚糖分離純化主要流程為脫色去除水溶性蛋白、鹽分、有機酸等其他雜質[11]，其中去除非糖物質方法主要有膜分離法[12]和微生物發酵法[13]，其能耗小，是目前公認較為高效經濟的方法。大豆低聚糖的檢測方法研究較多，但許多第三方檢測企業按照國標方法試驗發現基線穩定性較差，數據精密度、重復率和回收率均不理想[14]，因此尋找一種有效穩定的檢測方法是當務之急。

1 儀器檢測檢測方法

1.1 高效液相色譜-示差折光檢測法

大豆低聚糖的檢測目前使用較為廣泛是按照GB/T 22491—2008附錄A中的高效液相色譜-示差折光檢測法（HPLC-FID），采用反相鍵合相色譜。自2008年國標頒布以來，諸多文獻都對此方法進行了相應的改進，表1是4種文獻方法與國標方法檢測條件及結果的比較。

表1 不同年代文獻中高效液相色譜-示差折光檢測器檢測大豆低聚糖的比較表

表1 中文獻方法的檢測條件都是基于國標方法的優化，可以發現在2014年后，優化后的方法檢測時長隨著流動相乙腈的比重變大而變小，檢測的精密度和回收率也有較好的表現，且基線穩定。圖1、圖2分別為2010年文獻法與2014年文獻法的色譜圖，可明顯看出圖譜的基線變平穩，分離效果變好，檢測時間變短。

圖1 大豆低聚糖2010年文獻法的HPLC色譜圖

圖2 大豆低聚糖2014年文獻法的HPLC色譜圖

對于國標方法的改進研究還在繼續進行，通過更換流動相試劑、比例以及檢測器、色譜柱來提高檢測效果。但是國標方法對于樣品前處理需要進行衍生，且部分衍生劑只能作用于還原糖，同時產生的副產物會干擾檢測，因此，國標方法檢測低聚糖并非最好方法。鄧樹等人[19]對貓豆中低聚糖檢測，使用蒸發光散射檢測器低聚糖，在濃度0.04～0.4 mg·mL-1與峰面積線性良好，蔗糖RSD=1.2%、棉籽糖RSD=0.8%、水蘇糖RSD=1.0%，但是蒸發光散射檢測器線性范圍較小，相對于示差折射檢測器，適用性稍弱，因此后者應用較廣泛。

1.2 離子色譜-脈沖安倍檢測法

對于食品類樣品進行低聚糖檢測，為了避免樣品衍生法前處理，離子色譜-脈沖安倍檢測法（HPAECPAD）可作為一項較為可靠的檢測低聚糖的方法。安培檢測是一種電化學檢測技術，是用于測量電活性物質在工作電極表面發生氧化或還原反應時產生電流變化的檢測器，其主要優點是靈敏度高、選擇性好、響應范圍寬及結構簡單。糖類檢測一般使用脈沖安培檢測法（PAD），糖類化合物的pKa值為12～14，在強堿性介質中以陰離子形式存在，可以用陰離子交換色譜分離。脈沖安倍檢測器的參比電極一般使用Ag/AgCl電極，工作電極為金電極，原因是金電極的表面可為糖的電化學氧化反應提供反應環境且不需要衍生反應和復雜的樣品純化過程。基于糖的以上兩方面的特性，發展了一種對糖的選擇性好而且靈敏度高的色譜分析方法：高效陰離子交換色譜-脈沖安培檢測法（HPAEC-PAD）[20]。目前使用陰離子色譜-脈沖安倍檢測法使用的設備主要為ICS-5000離子色譜儀，國內研究者主要是對酸奶[21]和嬰幼兒配方奶粉[22-23]中大豆低聚糖（蔗糖、棉子糖和水蘇糖）進行檢測，其檢測條件結果比較見表2。

從表2及對應圖3～5中數據可知，文獻A的數據較好，文獻B優于文獻C，文獻A樣品中成分較少5種，因此用等梯度洗脫就能形成很好的分離，但是對于文獻B方法就有8種成分，文獻C有13種成分，隨著成分增加分離越困難，RSD也就越大，需采用梯度洗脫。同時，從圖3、圖4也可以明顯發現，隨著成分增多，基線的平穩性也會變差。色譜柱CarboPac PA1與CarboPac PA20也進行了比較，對于較多成分的分離，優選PA20，PA1會對大分子糖產生拖尾現象，保留時間延長，分離效果劣于PA20。

圖3 酸奶中低聚糖標準溶液離子色譜圖

圖4 嬰幼兒配方奶粉標準溶液離子色譜

表2 不同文獻中離子色譜-脈沖安倍檢測大豆低聚糖的比較表

圖5 嬰幼兒配方奶粉標準溶液離子色譜

此外，國外研究者KOTHA等人[24]運用離子色譜-脈沖安倍檢測法將23種干豆中的7種可溶性糖（葡萄糖、半乳糖、果糖、蔗糖、棉子糖、水蘇糖和毛蕊花糖）進行了分離測定，在0.156～20 μg·mL-1顯示出很好的線性（r2≥0.99）。由表1和表2 HPAEC-PAD檢測法與HPLC-FID方法線性范圍數據對比可知，HPAEC-PAD方法線性范圍約在0.1～100.0 mg·L-1，而HPLC-FID方法線性范圍約在0.1～20.0 mg·mL-1，HPAEC-PAD可檢測更低濃度的低聚糖，且無需衍生反應和復雜的樣品純化過程；而HPLC-FID中通過優化流動相條件，檢測時長可以明顯縮短，在較大的線性范圍內，相對標準偏差RSD和回收率等相關指標都有較好表現，可用于檢測低聚糖濃度含量較高的產品。

1.3 親水作用色譜-質譜法

親水作用色譜-質譜法是繼離子色譜-脈沖安倍檢測法后又一快速可靠的檢測方法，親水作用色譜（HILIC）是采用極性固定相（如硅膠或衍生硅膠）、含高濃度極性有機溶劑（如乙腈）和低濃度水溶液流動相的色譜模式，具有和反相色譜正交的選擇性，所使用的流動相與傳統反相色譜相似，弱洗脫劑為有機相，強洗脫劑為水相，可達到與反相色譜相似的柱效和對稱峰形，化合物的洗脫順序則與正相色譜相似，即以親水性增加的順序流出，極性小的物質先流出，極性大的物質后流出。

周鵬等人[25]利用此法檢測了茶葉中的低聚糖，結果表明各類糖在各自的線性范圍內呈良好線性，相關系數大于0.996，定量限為0.05～1.0 mg·L-1，回收率為90.1%～103.3%，相對標準偏差RSD為2.1%～5.4%。粱軍等人[26]利用親水作用色譜-質譜法測定麻黃根多糖單糖的組成，結果顯示該方法在12 min內實現8種未衍生單糖成分的完全基線分離，精密度、穩定性和重復性的RSD均＜2.1%，各成分的回收率為30%～99.3%。

2 其他檢測方法

2.1 紅外反射光譜法

針對低聚糖檢測的色譜類方法日益增多，除了上述主流方法外還有研究者利用紅外反射光譜法對低聚糖進行檢測，王瀟瀟等人[27]建立了大豆制品中寡糖含量的近紅外反射光譜預測模型，并探討樣品特性對預測效果的影響，以實現對其寡糖含量的快速預測。

2.2 核磁共振法

吉鑫等人[28]利用核磁共振法（NMR）測定食品中水蘇糖的含量，以檸檬酸作為定量外標，琥珀酸和煙酰胺分別作為定量內標，建立了食品中水蘇糖NMR定量分析檢測方法，水蘇糖標準品在0.025～6.40 g·L-1質量濃度范圍內線性良好，與現行行業標準方法相比，NMR法前處理操作簡便，實驗過程中避免了有機試劑的引入，單個樣品的檢測時間為7 min，極大地縮短了待測樣品的前處理時間，檢測效率顯著提高。NMR法還可以測定啤酒[29]中少量的化合物，無需將混合物分離。姜潔等人[30]利用NMR寬度法測定了嬰幼兒乳粉中蔗糖和乳糖的含量，它們在標準品與外標摩爾濃度比為0.05～5.00范圍內線性良好，相關系數均大于0.999；平均加標回收率為100.19%～103.21%，相對標準偏差在1.79%～3.57%，與色譜法相比該方法具有操作簡便、取樣量小、選擇性好、無需標準品作參比等優點。

此外，測定大豆低聚糖的方法還有薄層色譜層析法[31]、氣相色譜法[32]、液質聯用[33]，熒光光譜法[34]、蒽酮比色法[35]，但是這些方法相對于上述方法，準確度上有些差距。復合檢測方法也在不斷涌現，如薄層析聯合GC-MS、美拉德反應比色法、化學顯色比色法以及熒光分析法等，各類創新的低聚糖檢測方法會在檢測技術高速發展同時層出不窮。

3 結語

目前大豆低聚糖測定主要是對蔗糖（雙糖）、水蘇糖（三糖）和棉子糖（四糖）進行分離檢測，無論是哪種儀器分析方法，一般從進樣到出峰結束過程時間都不超過15 min，并且研究趨勢是朝快（檢測時間短）、精（標準偏差小）、準（加標回收率好）、靈（檢出限低）發展，數據分析更科學，檢測思路打破局限，基于大豆低聚糖的理化性質，組合檢測手段，優化檢測方法，降低檢測成本，真正意義上提升檢測效率。