異葉茴芹提取物藥用功效的研究

董瓊 李姣 劉永飛 楊光旭 胡媛媛 姜玉連 劉倩

異葉茴芹(Pimpinella diversifolia DC)隸屬于傘形科(Apiaceae)芹亞科(Apioideae)茴芹屬,為中國茴芹屬中最為廣布的一個種,又名山當歸、苦爹菜［1］。異葉茴芹作為民間常用草藥,常用于風寒感冒咳嗽、肺結核、痢疾等疾病的治療,具有解毒消腫、活血散淤的功能,還具抗腫痛、抗結核作用和一定程度的抗炎、止血、凝血活性［2,3］。目前有關異葉茴芹藥用功效的開發利用的研究較為少見,作者針對異葉茴芹提取物抗炎作用展開了實驗研究。

1 材料與方法

1.1材料來源 TD5A-WS 離心機、RE-6000 旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠)、FLUOstar Omega 多功能熒光酶標儀(BMG LABTECH)、FB224 電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)、地塞米松磷酸鈉注射液(山西省芮城科龍獸藥有限公司,批號：20190602)、角叉菜膠(上海伊卡生物技術有限公司,批號：20191021)、超聲清洗機(精密清洗機械有限公司)、異葉茴芹植株(采自浙江省溫州市永嘉縣楓林鎮高塘村),SPF 級昆明種雌性小鼠(長沙市天勤生物技術有限公司,許可證號：SCXK 2014-0011),體重35～45 g。

1.2實驗方法

1.2.1異葉茴芹粗提取物的功效研究

1.2.1.1異葉茴芹粗提物的制備 取異葉茴芹植株,干燥后切斷,粉碎后過60 目篩。用電子天平稱取5 g異葉茴芹粉末放入燒杯,加入體積分數60%乙醇溶液150 ml,在常溫下浸泡3 h,溫度為60 ℃,超聲40 min,超聲2 次,取燒杯中上清液。將取得的2 次上清液分別離心,再取離心管中上清液,裝入燒杯中,用保鮮膜封住燒杯口,放入冰箱冷藏貯存。

1.2.1.2小鼠分組飼養 適應性飼養小鼠7 d 后,選取健康小鼠42 只,隨機分為三組,標記為異葉茴芹提取物組、生理鹽水對照組、地塞米松組,每組14 只。均飼養于15～20 ℃,相對濕度45%～55%的清潔環境中,使用標準飼料,自由攝食和飲水。

1.2.1.3小鼠足腫脹實驗 參考已發表的文獻［4,5］,小鼠分組給藥連續7 d,小鼠灌胃劑量為0.2 ml/(次·只)。最后一次給藥前禁食不禁水16 h,給藥60 min 后于每只小鼠右后足腱膜下注射1%角叉菜膠0.04 ml,以左足為正常對照,致炎4 h 后,小鼠頸椎處脫臼處死,從小鼠膝關節處剪下左右兩后足,精密電子分析天平稱重。小鼠足腫脹度=右足重量(g)-左足重量(g),腫脹抑制率(%)=(空白對照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度)/空白對照組平均腫脹度×100%。

1.2.1.4小鼠腹腔毛細血管通透性實驗 參考已發表的文獻［4,5］,最后一次給藥后60 min,尾靜脈注射0.25%伊文思藍生理鹽水液5 ml 后,立刻腹腔注射0.6%冰乙酸5 ml,15 min 后,頸椎脫臼處死小鼠,腹腔注射6 ml 生理鹽水,輕搖小鼠腹部,剪開腹部皮毛,收集腹腔液,于3×103r/min 離心10 min,取上清液,用酶標儀于590 nm 處測定OD 值。

1.2.2不同藥量異葉茴芹提取物的功效研究 將“1.2.1.1”中制備的異葉茴芹提取物溶液使用旋轉蒸發儀旋蒸到溶液量<3 ml,再將所得溶液稀釋至3、6、12 ml。生藥量(g/ml)=投藥量/溶液體積。另選56 只昆明種小鼠,隨機分為高、中、低濃度組(總黃酮生藥量分別為1.67、0.83、0.42 g/ml)和空白對照組(等體積的生理鹽水),每組14 只。

1.2.2.1常壓耐缺氧性研究 參考已發表的文獻［6］,連續灌胃給藥7 d,灌胃劑量為每只小鼠0.2 ml/次。把小鼠放入盛有5 g鈉石灰的250 ml廣口瓶中,加蓋密封,以呼吸停止(小鼠胸部不起伏)為指標,記錄小鼠死亡時間。

1.2.2.2免疫效果研究 于最后一次給藥后24 h 對小鼠進行脫頸處死,稱重記錄后環切摘除小鼠的胸腺及脾臟,稱重并記錄,按照如下公式計算小鼠的脾臟指數及胸腺指數。脾臟指數=脾臟重量(mg)/小鼠稱重(g)。胸腺指數=胸腺重量(mg)/小鼠稱重(g)。

1.3統計學方法 采用SPSS19.0 統計學軟件對數據進行處理。計量資料以均數±標準差()表示,采用t 檢驗。P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1異葉茴芹粗提物對角叉菜膠致小鼠足腫脹抑制率的影響 異葉茴芹提取物組和生理鹽水組的腫脹度比較差異無統計學意義(P>0.05)；地塞米松組的腫脹度顯著低于生理鹽水組和異葉茴芹提取物組,差異具有統計學意義(P<0.05)；異葉茴芹提取物組腫脹抑制率顯著低于地塞米松組,差異具有統計學意義(P<0.05)。表明異葉茴芹粗提物具有輕微的抗炎效果,但其有效成分濃度并不高,有待進一步純化。見表1。

表1 異葉茴芹粗提物對角叉菜膠致小鼠足腫脹抑制率的影響(,%)

表1 異葉茴芹粗提物對角叉菜膠致小鼠足腫脹抑制率的影響(,%)

注：與地塞米松組比較,aP<0.05

2.2異葉茴芹粗提物對冰乙酸致小鼠腹腔毛細血管通透性的影響 地塞米松組OD 值低于生理鹽水組,但比較差異無統計學意義(P>0.05)；異葉茴芹提取物組OD值高于生理鹽水組,差異具有統計學意義(P<0.05)。說明地塞米松對于冰乙酸所引起的小鼠腹腔毛血管通透性具有一定的抑制作用,而異葉茴芹粗提物未有抑制作用,且提高了冰乙酸所引起的毛細血管通透性,可能是異葉茴芹粗提物中某種成分具有一定的毒性。見表2。

表2 異葉茴芹粗提物對冰乙酸致小鼠腹腔毛細血管通透性的影響()

表2 異葉茴芹粗提物對冰乙酸致小鼠腹腔毛細血管通透性的影響()

注：與生理鹽水組比較,aP<0.05

2.3異葉茴芹提取物對小鼠耐缺氧性的影響 中濃度組、低濃度組的死亡時間與空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)；高濃度組的死亡時間略高于空白對照組,但比較差異無統計學意義(P>0.05)。提示異葉茴芹中、低濃度劑量對提高小鼠的耐缺氧性均無明顯效果,僅異葉茴芹高濃度有效,但效果甚微,可能是其含有的有效成分含量不高。見表3。

表3 異葉茴芹粗提物對小鼠耐缺氧性的影響(,min)

表3 異葉茴芹粗提物對小鼠耐缺氧性的影響(,min)

注：與空白對照組比較,aP>0.05

2.4異葉茴芹提取物對小鼠免疫功能的影響 中濃度組脾臟指數顯著高于空白對照組、高濃度組、低濃度組,差異具有統計學意義(P<0.05),可能是因為在飼養過程中有小鼠打架受傷,導致脾臟指數增高?？瞻讓φ战M脾臟指數顯著低于高濃度組、中濃度組、低濃度組,差異具有統計學意義(P<0.05),說明異葉茴芹提取物對小鼠脾臟指數有一定的影響。在胸腺指數中,高濃度組小鼠的胸腺指數最高,其次為低濃度組、空白對照組,中濃度最低,但組間比較差異均無統計學意義(P>0.05)。說明不同濃度的異葉茴芹提取物對小鼠免疫功能的影響有所不同。見表4。

表4 異葉茴芹提取物對小鼠免疫功能的影響()

表4 異葉茴芹提取物對小鼠免疫功能的影響()

注：與空白對照組比較,aP<0.05；與中濃度組比較,bP<0.05

3 討論

由本研究結果可知,異葉茴芹提取物在抑制角叉菜膠引起的小鼠足腫脹、提高小鼠耐缺氧性、提高小鼠免疫功能方面有一定的作用,但效果不顯著。在冰乙酸致小鼠腹腔毛細血管通透性實驗中異葉茴芹提取物未見有抑制效果,且產生了反作用,說明直接灌胃異葉茴芹提取物可能對小鼠的某些部位產生了不良影響,而引起了腹腔毛細血管通透性提高。因此,對于如何安全、有效地進一步開發利用異葉茴芹仍有待深入研究。

趙良輝等［7］研究發現,異葉茴芹總黃酮具有較好的體外抗氧化活性,在羥基自由基的清除上,異葉茴芹總黃酮優于同等濃度的Vc,在較低pH 值、一定的濃度和時間內,能夠有效地清除亞硝酸鈉,在pH 值=3.0時,異葉茴芹總黃酮在試驗濃度范圍內,能有效地抑制亞硝胺的合成。本研究在此基礎上,展開了小鼠常壓耐缺氧實驗,但結果表明異葉茴芹提取物對小鼠耐缺氧能力的改善效果并不明顯。黃酮類化合物在增強免疫功能等方面的作用有效［8］,灌胃給藥異葉茴芹提取物的小鼠,其脾臟指數及胸腺指數并未出現顯著變化,可能緣于給藥時間需要進一步延長。已有的研究工作中［3］,異葉茴芹醇提物和異葉茴芹水提物均對二甲苯所致小鼠的耳廓腫脹度具有極為明顯的影響,可以降低二甲苯致小鼠耳廓腫脹的程度。

綜上所述,異葉茴芹提取物對角叉菜膠所引起的足腫脹有一定的抑制,但可能由于粗提物中化學成分復雜,有效的抗炎成分占比低,有必要提純精制后再進行利用。