響應面優化沙棘果多糖提取工藝 ①

李洪超,趙宏博,趙 宏,沈 宇

(1. 佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007；2. 佳木斯大學康復醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

沙棘(Hippophae rhamnoides L.)又名醋柳果，酸刺果，隸屬胡頹子科沙棘屬，落葉灌木或喬木[1]。沙棘的根、莖、葉、花，特別是果實中含有豐富的營養成分和生物活性物質，其維生素C的含量遠遠高于鮮棗和獼猴桃，從而被譽為天然維生素的寶庫[2]。沙棘果多糖是從沙棘果中提取的水溶性多糖。近年來，經過我國專家研究，沙棘多糖的藥用價值不斷被發現，引起越來越多的人對沙棘果進行研究探索。

超聲輔助提取法是應用超聲波強化提取植物多糖的方法，是一種物理破碎過程[3]。與常規提取法相比，超聲波提取可縮短提取時間，提高提取率，所以超聲提取在植物多糖的提取中得到廣泛應用。本研究選取沙棘果為原材料，采用超聲波輔助法提取沙棘果多糖。采用響應面分析法，在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken中心組合實驗設計原理對提取工藝條件進行優化[4～7]。為沙棘果多糖的研究及應用提供一定得理論依據及實驗數據。

1 材料與儀器

哈爾濱裕嘉源農業有限公司提供新鮮的沙棘果，DPPH(美國Sigma公司)，95%乙醇(山東利爾康消毒科技股份有限公司)，葡萄糖標準品(天津市科密歐化學試劑有限公司)，維生素C(天津市科密歐化學試劑有限公司)，濃硫酸(天津市科密歐化學試劑有限公司)，苯酚(天津市科密歐化學試劑有限公司)，三氯乙酸(上海研生實業有限公司)。

FA2004N型電子分析天平(上海恒平科學儀器有限公司)，757型紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)，中空纖維膜(湖州科濾膜技術有限公司)。

2 方法

2.1 沙棘果多糖的提取

準確稱取沙棘果干粉1000g，按照固液比1:5，加入5000mL石油醚，設定回流溫度為70℃，回流時間為2h，進行石油醚回流脫脂。加入30L蒸餾水，在提取溫度60℃、提取功率100W的條件下進行超聲提取45min。將提取液用8層紗布趁熱過濾，濾液進行濃縮，冷卻至室溫后，加入95%乙醇，調乙醇濃度為80%以上，用保鮮膜封口后，置于室溫中醇沉24h。用離心機3000r/min將醇沉液離心15min，取下層沉淀，置于陰涼處干燥后得沙棘果多糖粗產品。

2.2 沙棘果多糖含量的測定

2.2.1 標準曲線的制定

取濃度為0.1mg/mL的標準葡萄糖溶液，分別吸取葡萄糖標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別補水至2.0mL，以蒸餾水作為空白對照組，分別加入5%的苯酚1mL，濃硫酸5mL，搖勻，在室溫下靜置10min，置于40℃水浴中保溫15min后冷卻至室溫。用紫外可見分光光度計測定波長在490 nm處的吸光度，繪制標準曲線。得回歸方程：y=0.8913x+0.0102，R2=0.9994，其中x為多糖質量濃度，y為吸光度。

2.2.2 多糖含量的測定

精密稱取干燥多糖樣品10mg，定容至100mL容量瓶中，吸取2mL，按照2.2.1中所述的方法進行操作，平行3次實驗取平均值。

多糖含量(%)=

第二，馬克思主義是革命的理論。列寧指出：“馬克思認為他的理論的全部價值在于這個理論‘按其本質來說，它是批判的和革命的’。后一性質的確完全地和無條件地是馬克思主義所固有的，因為這個理論公開認為自己的任務就是揭露現代社會的一切對抗和剝削形式，考察它們的演變，證明它們的暫時性和轉變為另一種形式的必然性，因而也就幫助無產階級盡可能迅速地、盡可能容易地消滅任何剝削。”[1]82-83以往的一切所謂“科學”都在為人剝削人的制度進行辯護，只有馬克思主義對這種人剝削人的制度進行了無情的批判，毫不掩飾自己的階級性，公開宣布它就是要代表無產階級利益，為無產階級的革命運動服務。

2.3 沙棘果多糖提取的單因素試驗

取干燥沙棘果實，粉碎，浸泡過夜，按照表1所設定的條件，分別進行單因素試驗考察。

表1 超聲提取法提取條件因素水平

2.4 響應面法優化多糖的提取工藝

在單因素試驗基礎上，采用Box-Behnken響應面設計對沙棘果總多糖提取條件進行優化[8～12]。以四因素三水平的響應面分析法確定影響沙棘果多糖提取率的水平因素編碼設計，每個因素選取高、中、低三個水平，共29個試驗點，響應面試驗設計編碼變量見表2。

表2 響應面試驗設計編碼變量

3 結果與分析

3.1 含量的測定結果

將沙棘果粗多糖在波長490nm處測得吸光度，根據葡萄糖標準曲線的回歸方程y=0.8913x+0.0102，計算得出沙棘果粗多糖的含量為39%。

3.2 單因素試驗的結果

3.2.1 料液比對多糖提取率的影響結果

考察不同料液比(1:10、1:20、1:30、1:40、1:50)對多糖提取的影響。由圖1可知，多糖含量隨著料液比的增大先增大后減小，當料液比為1:30時，沙棘果多糖的含量最佳，達34.15%。

3.2.2 提取時間對多糖提取率的影響結果

考察不同提取時間(15、30、45、60、75min)對多糖含量的影響。由圖1可知，提取率隨著提取時間的增大先增大后減小，當提取時間為45min時，沙棘果多糖的提取率最高，達3.919%；由圖1可知，多糖含量隨著提取時間的增加先增大后減小，當提取時間為45min時，沙棘果多糖的含量最佳，達34.65%。

圖1 料液比、提取時間、提取功率、提取溫度對沙棘果多糖提取含量的影響

考察不同提取功率(60、70、80、90、100W)對多糖含量的影響。由圖1可知，多糖含量隨著提取功率的增大而增大，當提取功率為100 W時，沙棘果多糖的含量最佳，達34.90%。

3.2.4 提取溫度對多糖提取率的影響結果

考察不同提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)對多糖含量的影響。由圖1可知，多糖含量隨著提取溫度的增大先增大后減小，當提取溫度為60 °C時，沙棘果多糖的含量最佳，達33.20%。

3.3 響應面法優化提取工藝結果

3.3.1 試驗條件與試驗結果

選取料液比、提取時間、提取功率和提取溫度作為影響沙棘果多糖提取率的因素。采用Box-Behnken設計方案及結果見表3。

表3 響應面試驗設計編碼變量與結果

圖2 響應面結果

3.3.2 響應面結果分析

根據Design-Expert 軟件采用中心組合試驗Box-Behnken設計方案繪制響應面3D分析圖。由圖2可知，曲線陡峭程度最高且極值點均落在試驗考察去內，提取時間與提取功率兩因素對響應值影響顯著。

3.4 沙棘果多糖提取工藝的優化和驗證

根據Box-Behnken設計方案的計算結果，確定最佳工藝條件為：提取時間45.29 min，提取溫度61.48℃，提取功率90 W，料液比1:30.88，沙棘果多糖的提取率預測值為4.023%。考慮到實際操作的便利，確定沙棘果多糖的提取率的最佳工藝參數為提取時間46min，提取溫度62℃，提取功率90W，料液比1:31。對響應面法優化的沙棘果多糖的最佳提取工藝進行5次重復驗證試驗，提取率分別為3.994%、3.996%、3.987%、3.998% 和4.000%。沙棘果多糖的平均提取率為3.995%與模型得出的理論提取率4.023% 接近，表明響應面分析優化沙棘果多糖的提取工藝條件穩定可行。

4 討論

本文采用超聲波輔助法提取沙棘果多糖，在單因素試驗優的基礎上，利用Design-Expert軟件，采用Box-Behnken建立沙棘果多糖提取模型。對響應面分析法優化的沙棘果多糖的最佳提取工藝進行5次重復驗證試驗，平均提取率與理論提取率接近，表明響應面分析法穩定可行。用響應面分析法優化沙棘果多糖的提取工藝參數具有可行性、可靠性，優選得到的最佳工藝條件穩定。有進一步研究和開發的必要。