黑龍江雪菊總黃酮提取工藝研究 ①

閆鵬舉，劉宇龍，李曉芳，王 佳，郭英雪

(佳木斯大學藥學院，黑龍江 佳木斯 154007)

雪菊學名“蛇目菊”、“雙色金雞菊”，別名“血菊”，菊科(Compositae)，蛇目菊屬(Sanvitalia)，蛇目菊種。雪菊形狀如雛菊，花瓣呈金黃色，花蕊呈棕色，為一年生草本植物。雪菊主要生長在昆侖山海拔3000米以上，人煙稀少、常年積雪的環境中，因此雪菊花期短暫，采摘不易，產量不多。當地居民一直有以雪菊代替花茶飲用的習慣，長期飲用發現，雪菊具有降低“三高”、預防心腦血管疾病等作用，有益身體健康[1,2]。目前，已經從雪菊中分離、鑒定出超過20類、300多種天然成分，其中黃酮類化合物有30多種。雪菊中的黃酮含量高達12%，遠遠超過了其他菊類。黃酮作為一種抗氧化劑，不僅具有清除體內氧自由基的作用，而且可以防止細胞衰老及癌變，還可以抗腫瘤、降血脂、降血壓、調節血糖以及抗衰老等，還有研究表明，雪菊還具有殺菌、消炎、減肥、預防感冒和治療慢性腸炎的功效，對于失眠也有相當好的調理作用[3～6]。

黑龍江省佳木斯市位于世界僅存的三大黑土平原之中，土壤肥沃，年有效積溫平均值為21℃，具有雪菊種植的優質條件。目前佳木斯已經成功的引種栽培了新疆昆侖雪菊。一直以來關于雪菊的研究都是圍繞著新疆等地種植的昆侖雪菊展開的，而黑龍江產地雪菊的研究較少。本文采用的研究對象為黑龍江地區種植的雪菊，以提取物中總黃酮含量為考察標準探究最佳提取工藝，通過超聲輔助提取法對黑龍江雪菊進行提取，確定黑龍江雪菊總黃酮的最佳提取工藝。旨在為研究黑龍江雪菊的研究提取打下基礎，并對黑龍江雪菊產業化開發提供科學的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

蘆丁標準品(中國藥品生物制品檢定所);黑龍江本地產雪菊；UV-757 CRT型紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司);RE-52型旋轉蒸發器 (上海亞榮生化儀器廠);SHB-Ⅲ型循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司);KQ-500DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Ⅲ型電熱鼓風干燥箱(江蘇省金壇市大地自動化儀器廠);DRT-SX型數顯恒溫加熱套(鄭州長城科工貿有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 建立蘆丁標準曲線

準確稱取蘆丁標準品10.03mg，經70%乙醇溶解后定容至25mL容量瓶中，作為儲備液備用。分別精密稱取蘆丁標準溶液儲備液1mL，2mL，3mL，4mL和5mL于5只25mL容量瓶中，分別加入6mL的三蒸水，加入5%亞硝酸鈉1mL，搖勻，放置6min后加入10%硝酸鋁1.0mL，搖勻，6min后再加入10%氫氧化鈉10mL，混勻，用三蒸水定容至刻度，15min后測定其吸光度值，于波長508nm處進行吸光度測定，參比為空白試劑，以蘆丁濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標作標準曲線，得蘆丁濃度C與吸光度A的標準曲線線性回歸方程式[7]。

1.2.2 黑龍江雪菊總黃酮提取單因素試驗

按照表1所設定的條件：料液比、提取時間、乙醇濃度這3個因素，分別進行單因素試驗考察。

表1 超聲輔助提取單因素水平

1.2.3 響應面法(BBD)優化雪菊總黃酮提取工藝

通過單因素考察的結果可知，乙醇濃度、提取時間和料液比均對雪菊提取物中總黃酮的含量有影響，應用響應面法(BBD)按照表2所示條件，對提取工藝進行優化。

表2 響應面法(BBD)優化試驗因素水平

1.2.4 最佳提取工藝驗證

按照響應面法(BBD)試驗預測的雪菊總黃酮最佳提取工藝，平行實驗提取3次，計算提取率及偏差。

1.2.5 黑龍江雪菊總黃酮含量測定

準確稱取干燥后的雪菊提取物粉末10mg，用70%乙醇溶解，定容至25mL容量瓶中作為供試液。吸取供試品溶液1mL于25mL容量瓶中，加水至 6mL，在508nm處測定其吸光度，記錄吸光度值。根據公式(1)計算雪菊提取物中總黃酮的含量。

雪菊提取物中總黃酮的計算公式為：

(1)

C：雪菊樣品中總黃酮濃度(mg·mL-1)，V：樣品溶液體積(mL)， W：待測樣品重量(mg)。

2 結果與討論

2.1 蘆丁標準曲線的繪制

以蘆丁標準品溶液濃度C(mg/mL)為橫坐標，吸光度值A為縱坐標繪制蘆丁標準曲線，如圖1所示，吸光度A與樣品的濃度C(mg/mL)呈線性關系，其標準曲線的回歸方程為A=11.11111C-0.06904，R2=0.99593。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 黑龍江雪菊總黃酮提取工藝的結果

在單因素(料液比、提取時間和乙醇濃度)試驗結果的基礎上，按不同組合提取條件提取總黃酮，以提取物中總黃酮含量為響應值，進行實驗，實驗組合條件，以及各個組和條件下雪菊提取物中總黃酮含量見表3。

表3 響應面分析方案及試驗結果

表4 回歸模型方差分析

在參數評估基礎上，利用Design-Expert 8.0.5得到響應值和被檢變量間的邏輯關系。多重回歸分析實驗數據，用下列多元二次方程預測計算雪菊中總黃酮含量的預測值(Y)：Y=72.11+0.71A+1.52B+0.85C+0.21AB-0.54AC-1.73BC-5.72A2-4.28B2-7.86C2，其中A，B，C分別是料液比、提取時間和乙醇濃度的編碼。

根據回歸結果分析，做出對應曲面圖如圖2。通過分析得出最佳工藝條件為：料液比1:20、提取時間30 min、乙醇濃度70%，預測該提取工藝提取得到雪菊提取物中總黃酮含量為72.11%。

圖2 a 料液比與提取時間對黑龍江雪菊總黃酮含量的效應曲面圖

2.3 最佳提取工藝驗證

通過進一步試驗對模型進行驗證，對雪菊總黃酮提取進行平行試驗，測得實際黑龍江雪菊提取物中總黃酮含量平均為72.52%，實際提取率和預測提取率RSD值為2.20%，實際測定值和模型計算值間的相對標準偏差<3%，說明該模型較為可靠。

3 討論

雪菊營養價值豐富，具有多種黃酮類化合物、十多種對人體有益的氨基酸和豐富的維生素，而且還具有很多人體所必需的酶，其藥用價值遠遠超過了一般的花茶[7]。本文考察超聲波輔助提取法對黑龍江雪菊中總黃酮的提取，并用紫外分光光度法對提取液中總黃酮含量進行測定，通過對提取條件的單因素考察和響應面法(BBD)優化試驗設計，以雪菊提取物中總黃酮含量為評價指標，確定確定黑龍江雪菊提取總黃酮的最佳工藝為：乙醇濃度70%，料液比1:20，提取時間30 min。在此最佳提取工藝條件下，黑龍江雪菊提取物中總黃酮含量為72.11%。目前佳木斯已經成功的引種栽培了新疆昆侖雪菊并且對引種栽培的雪菊逐漸展開深入的研究，在對其化學成分提取、分離的基礎之上，還會研究其藥理作用及質量標準的建立，進而開展對黑龍江雪菊的全方面開發及應用。