Th22細(xì)胞及IL-22、IL-9因子在肺癌患者外周血中的表達(dá) ①

王 晶,曲修勝,馬雪梅,李樹民,楊曉東,李 娜

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 154003)

原發(fā)性支氣管肺癌簡(jiǎn)稱肺癌，是我國(guó)病死率最高的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害人類健康，依據(jù)GLOBOCAN估算，2012 年全球患有癌癥人數(shù)可達(dá)1410 萬(wàn)人，因其死亡人數(shù)達(dá)820 萬(wàn)，其中肺癌是最常見的腫瘤之一[1]，因此更早的期診斷、治療肺癌有著非常重要的意義。近年來(lái)，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Th22 細(xì)胞是一種的新型、獨(dú)立的 CD4+輔助性T細(xì)胞亞群，IL-22是其分泌的重要細(xì)胞因子，在腫瘤疾病中，已經(jīng)有研究表明Th22細(xì)胞及其分泌的IL-22因子在肝癌、胃癌等均有表達(dá)[2]，在胰腺癌中，IL-22也可以通過(guò)STAT3通路加強(qiáng)胰腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)[3]。而IL-9是于2008年被研究發(fā)現(xiàn)主要由Th9分泌的擁有促炎作用的CD4細(xì)胞亞群，通過(guò)激活STAT3磷酸化也能促進(jìn)人胰腺癌生長(zhǎng)[4]，因此二者可能在腫瘤疾病中存在某種聯(lián)系，但對(duì)于Th22、IL-22與IL-9在肺癌中的關(guān)系鮮有報(bào)道，因此本研究擬探討Th22細(xì)胞、IL-22與IL-9在肺癌發(fā)病中的表達(dá)情況及相關(guān)性分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

肺癌組選取2018-11～2019-05在我院確診的肺癌患者35例作為實(shí)驗(yàn)組；年齡42～78歲，平均65歲，男21例，女14例，所有病例均經(jīng)病理組織學(xué)檢測(cè)確定為肺癌，健康對(duì)照組35 例，為同期于我院體檢的健康者，其中男25例，女10例，年齡40～82歲，平均70歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)年齡>18歲；2)已確診并明確病理及組織分型的原發(fā)性肺癌患者；3)既往未接受過(guò)放化療治療，并且未應(yīng)用免疫抑制劑治療的患者。實(shí)驗(yàn)排除標(biāo)準(zhǔn)：1)有肺結(jié)核、肺部急性感染等其他肺部疾病的肺癌患者；2)有嚴(yán)重心、肝、腎功能有異常的患者；3)有其他惡性腫瘤史的癌癥患者；所收集的實(shí)驗(yàn)組35例患者研究資料收集經(jīng)研究對(duì)象知情同意，遵守倫理學(xué)的各項(xiàng)規(guī)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法1.2.1 主要儀器及試劑

美國(guó)BD公司流式細(xì)胞儀、芬蘭(Labsystems Multiskan MS)公司352型酶標(biāo)儀、中國(guó)海爾4℃和-20℃冰箱，-80℃超低溫冰箱，北京索萊寶科技有限公司人外周淋巴細(xì)胞分離液、BD PharMingen、anti-CD4-APC試劑、Biolegend、anti-IL-22-PE，及相應(yīng)同型對(duì)照抗體，莫能霉素及破膜劑均來(lái)自美國(guó)BD公司，ELISA 檢測(cè)試劑盒(上海信帆生物科技有限公司)。

1.2.2 方法

1.2.2.1 血液標(biāo)本的采集: 用肝素抗凝采血管采集入組病人的靜脈血4mL,用非抗凝普通采血管采集靜脈血1mL, 冰盒保存并于1h內(nèi)轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)中心待用，待血液凝固后，將1mL全血2500rpm 4℃離心10min，取上清液分裝于 EP 管中，每管 50μL，保存于-80℃低溫冰箱。

1.2.2.2 Th22細(xì)胞的檢測(cè): 將經(jīng)過(guò)肝素鈉作抗凝處理的新鮮采集的外周4mL全血標(biāo)本取出，混勻，加入PBS液8mL,進(jìn)行稀釋；小心提取外周血單個(gè)核細(xì)胞后，將上述液體孵育4h后取出孵育板，使用移液器將收集培養(yǎng)箱中細(xì)胞，盡量全部吸出，分別轉(zhuǎn)移到2個(gè)流式管中，標(biāo)記為對(duì)照管和檢測(cè)管，加入PBS吹打混勻，1200rpm×5min洗滌1遍后棄上清；分別吸取熒光標(biāo)記的表面抗體，anti-CD4-APC-H7加入檢測(cè)管中，對(duì)照管中加入相應(yīng)同型對(duì)照抗體，充分混勻，靜置30min；2mL PBS洗滌一次，200μL的4%多聚甲醛重懸，室溫靜置20min后，兩管中分別加入1mL破膜劑，震蕩混勻，避光孵育后，分別再向兩管中加PBS 5mL,離心5min棄上清，RPMI1640重懸；向檢測(cè)管加入細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子抗體 anti-IL-22-PE；并向?qū)φ展苤屑尤胪蛯?duì)照抗體，充分混勻后，4℃條件下避光孵育30min；PBS5mL洗滌后重懸，將重懸后的細(xì)胞液體采用 BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè) ，結(jié)果以CD4+IL-22+T細(xì)胞在CD4+T細(xì)胞中所占百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.2.3 IL-22、IL-9的檢測(cè)： 將待測(cè)標(biāo)本及ELISA試劑盒預(yù)先從冰箱拿出，并拆除密封袋，核對(duì)好所需實(shí)驗(yàn)試劑，嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA) 試劑盒操作步驟檢測(cè)血清中IL-22、IL-9 表達(dá)水平，測(cè)出OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Th22細(xì)胞的表達(dá)水平

肺癌患者與健康對(duì)照組外周血中，Th22細(xì)胞(CD4+IL-22+T)、IL-22、IL-9因子的表達(dá)水平見表1；可以看出，實(shí)驗(yàn)組Th22、IL-22的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，差異有顯著性；實(shí)驗(yàn)組IL-9表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05)，差異有顯著性。見圖1～2。

表1 肺癌患者與健康人群Th22細(xì)胞、IL-22、IL-9因子的表達(dá)水平

圖1 肺癌組與對(duì)照組Th22表達(dá)水平

圖2 肺癌組與對(duì)照組IL-22、IL-9的表達(dá)水平

2.2 相關(guān)性分析

肺癌患者中，Th22、IL-9與IL-22表達(dá)相關(guān)性分析見圖3～4； 經(jīng)Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，肺癌實(shí)驗(yàn)組患者外周血中，Th22、IL-22呈正相關(guān)(r=0.605，P<0.01),IL-22與IL-9呈正相關(guān)(r=0.58,P<0.05)。

圖3 Th22與IL-22相關(guān)性分析

圖4 IL-22與IL-9相關(guān)性分析

3 討論

肺癌是世界范圍內(nèi)因腫瘤疾病死亡主要原因之一，臨床上在治療無(wú)效的原因多是轉(zhuǎn)移和耐藥，較早的發(fā)現(xiàn)腫瘤，是治療腫瘤疾病重要的一個(gè)環(huán)節(jié)[5]。體液免疫和細(xì)胞免疫組成了機(jī)體的免疫系統(tǒng)，而細(xì)胞免疫在抗腫瘤中發(fā)揮重要作用，在細(xì)胞免疫中起主要作用的效應(yīng)細(xì)胞是 CD4+T淋巴細(xì)胞[6]。 Duhen T等人在2009年發(fā)現(xiàn)Th22細(xì)胞是一種新型 Th 細(xì)胞， 并提出高分泌IL-22細(xì)胞因子，因此對(duì)于二者的研究越來(lái)越多[7]，Th22細(xì)胞及效應(yīng)因子IL-22因子存在很多疾病中，在炎癥性疾病中，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡中、系統(tǒng)性硬化癥、白塞病中，二者均高表達(dá)[8]，另外還參與了表皮免疫和修復(fù)，在腫瘤系統(tǒng)疾病中， Curd[9]等實(shí)驗(yàn)提出，IL-22在人胰腺癌中能夠引起STAT-3磷酸化，這表示IL-22在人胰腺癌細(xì)胞中促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。在乳腺癌中， 實(shí)驗(yàn)組Th22細(xì)胞、IL-22因子表達(dá)高于對(duì)照組[10]。IL-9是機(jī)體重要免疫因子之一，有研究證實(shí)，其能夠參與惡性腫瘤疾病的發(fā)生，在肝癌患者中，IL-9能夠使肝癌細(xì)胞增殖，并且在肝癌腹水中表達(dá)增強(qiáng)[11]，在胰腺癌裸鼠移植瘤研究中，IL-9能夠通過(guò)激活 STAT3磷酸化促進(jìn)其生長(zhǎng)，并且縮短裸鼠的生存壽命[12]。但對(duì)于Th22、IL-22與IL-9在肺癌患者外周血的表達(dá)及相關(guān)性鮮有報(bào)道。

本研究結(jié)果提示，肺癌患者外周血中，Th22細(xì)胞與IL-22因子表達(dá)較健康對(duì)照組升高，由圖3也可以看出二者呈正相關(guān)，更加說(shuō)明IL-22由Th22分泌，Th22通過(guò)介導(dǎo)分泌IL-22參與肺腫瘤的發(fā)生發(fā)展。IL-9在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組，IL-22因子與IL-9二者呈正相關(guān)，可能與二者促進(jìn)STAT-3通路加快肺腫瘤的生長(zhǎng)有關(guān)，這表明Th22細(xì)胞、IL-22因子與IL-9在肺腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，可能促進(jìn)人類肺腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展，具體機(jī)制可能與其能夠促進(jìn)STAT3磷酸化有關(guān)，STAT3是雙功能蛋白，主要是能通過(guò)酪氨酸磷酸化通路發(fā)揮作用，在人腫瘤疾病中表達(dá)升高[13]。 在肺腫瘤疾病中的作用，需要進(jìn)一步研究。可以通過(guò)調(diào)節(jié)Th22 細(xì)胞及IL-22、IL-9因子表達(dá)，從而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫狀態(tài)，為肺腫瘤疾病的防治策略提供依據(jù)。