局部應用脂源性間充質干細胞促進瘺管的愈合的相關動物研究 ①

朱曉文，倪 健，鄒玉梅，陳福軍

(佳木斯大學附屬第一醫院普外四科， 黑龍江 佳木斯 154003)

肛瘺是一種慢性疾病，需要手術治療。如果同時伴有克羅恩病(CD)[1]，則治療更為困難和延長。保守治療的有效率低于40%，瘺管通常不會完全愈合。保守治療與手術治療相結合已被證實療效提高約40%～60%。最近相關研究報道，使用局部應用間充質干細胞(MSCs)可能成為一種新的、更有效治療方法[2]。MSCs的特點是快速擴張、多效性、免疫調節作用以及通過刺激局部修復過程和血管生成來支持愈合。最近的幾項研究評估了MSCs在克羅恩病(CD)患者小群體中應用的效果。使用脂肪源干細胞(ADSCs)以及與骨髓分離的同種異體細胞。在干預后，治愈率在第24周達到85%。然而，在隨訪數年之后，只有37%～58%的患者出現了長期的影響[4,5]。在第一個大的多中心隨機試驗(212例患者)中，短期內在完成了ADSCs的異體應用后46%的患者中病情得以緩解[7]。治療的臨床效果不僅受到肛周區域的局部檢查的影響，還受到臨近疾病活動和保守治療反應的影響[8,9]。

生物發光(BLI)成像技術是一種強大的技術，它允許在接受者的身體內對移植的細胞進行實時的非侵入性追蹤。基質的管理(D -熒光素)在供體細胞中引發酶反應，導致光子的發射。考慮到這種反應只能發生在有活力的細胞中，故BLI可以識別出細胞的分布和數量[11]。這項研究的目的是評估ADSCs在動物模型上應用ADSCs對瘺管愈合的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

32只250～350g的Lewis雄性大鼠。所有動物在實驗前至少2周都在動物中心的目標設施的上進行了馴化。在研究過程中，維持了12h的陽光和黑暗循環，并提供了大量的食物和液體。實驗結束后，動物被安樂死，注射了致命劑量的硫噴妥鈉。

所有的實驗都是在佳木斯大學臨床醫學院和基礎醫學院所認可的實驗工作場所進行的，經過倫理委員會的批準，并根據關于動物使用的指導方針進行。

1.2 方法

1.2.1 瘺的模型建立

32只大鼠均于計劃干預前4周建立瘺管模型。用布爾特曼等方法描述了一種改進的結腸造瘺術[10]。動物通過肌內注射鹽酸替利他胺，佐拉西泮和甲苯噻嗪混合麻醉藥物，用5mL的佐拉西泮+ 7mL的甲苯噻嗪和生理鹽水(8mL)在手術前30min用0.1mL/200g動物體重的比例使用。在背部固定后，做了一個2～2.5cm的剖腹手術。盲腸區依次切開皮膚、筋膜和肌層進入腹腔。通過皮下隧道從腹腔鏡下模擬瘺道暴露出盲腸。然后，打開腸壁，在它的邊緣固定有4個0的縫線直到皮膚。在這一端模擬了一個外部開口。在止血處理后，剖腹手術的所有層次都依次縫合關閉，動物被放置在生物室。在隨機化之前，所有的瘺管都經過證實有糞便分泌和探針檢查，可以自由地通過瘺道。此外，對前3只大鼠進行了瘺管造影，以驗證該技術的準確性。

1.2.2 ADSCs的隔離和培養

自交供體Lewis大鼠脂肪組織中表達熒光素酶基因。采集腹股溝脂肪墊(0.5 1cm3)，同時使用2%異氟醚短時間吸入麻醉(異氟醚)。隨后將其切成小塊，在添加10%牛血清的H-MEM中消化一整夜，溶解于0.05%或0.1%的膠原酶溶液中。在5mL移液管中反復移液分離組織，用培養基稀釋懸浮液，800G離心8min。丟棄上清；將含有細胞的托盤接種到25cm2細胞培養皿中，加入完全培養基(含所有非必需氨基酸的H-MEM；2.5ng/mL表皮生長因子；0.12g/L丙酮酸鈉；1g/L nahco3；1g/L谷氨酰胺；10%牛血清；1%胎牛血清，200U/mL青霉素和100lg/mL鏈霉素)，在3.5%的CO2孵育箱中，設定溫度為37℃。培養基每2、3天更換一次。臺盼藍染色后，在B urker室檢測細胞計數和活力。

1.2.3 分組、ADSCs治療及療效評估

瘺驗證后，使用2%的異氟醚吸入性麻醉后，這些動物隨機分組。治療組(A組)和對照組(B組)。A組(n=16), 2mL濃度為2×106細胞/mL的ADSCs懸液注入在瘺口周圍。B組(n=16),適量的鹽水(安慰劑)注入同一區域。然后將動物放回容器中。

使用已建立的瘺管引流評估方法，在使用ADSCs后的第7、14、30天在同一短麻醉下內對瘺管治療進行評估。在輕度受壓后的外開口出現膿性或糞便樣分泌物，瘺管則被認為是開放的[12]。此外，還使用了一個2mm的探針來驗證整個瘺道是否閉合。

監測ADSCs的可行性和分布情況情況則在第2、7、14和30天進行。首先，用150mg/kg D-熒光素溶液給動物注射。然后，老鼠被放置在攝像機的房間里-IVIS Lumina XR，在2min的曝光中檢測了酶反應釋放的光子數量。隨后，BLI被量化到瘺管周圍的固定興趣區域。在一個直徑2.5cm的圓內，以每秒每平方厘米每立體視界的光子數p(s·cm2·sr)使用生活圖像軟件(PerkinElmer)分析。在與BLI強度相關的基礎上，評估了可行ADSCs的相對含量。應用程序后立即測量的信號作為參考(100%)。

1.3 統計學方法

采用SPSS25.0統計軟件分析，檢測數據，組間均數比較采用單因素方差分析檢驗方法，資料服從正態性和方差齊性，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 治療效果分析

在A組或B組中使用ADSCs或安慰劑后無并發癥或不良反應，無任何動物死亡。這些動物茁壯成長并獲得足夠的重量。干預后7天，A組5例(31%)瘺管和B組1例(6.3%)瘺管關閉。另有1只A組大鼠在第2周內痊愈。干預后第30天, A組和B組分別有6只(38%)和1只(6.3%)大鼠瘺管被關閉,分別(P=0.033)。見圖1。

圖1 給藥后瘺管愈合的大鼠數量情況

2.2 BLI(熒光輻射強度)及干細胞存活比率變化

在應用ADSCs后，BLI的高活性只被記錄在周圍區域。這種信號在動物身體的任何其他部位都無法檢測到。A組的BLI值在植入后立即達到最高—31.2×104(6.09～111×104)p(s·cm2·sr)。信號強度下降最快的是在前兩天，數值下降了50.2%。在第30天，輻射強度為2.77×104(0.156～16.9×104)，代表其原始值的8.87%。見表1。B組BLI的水平在整個期間為零。比較A組大鼠愈合樣本和未愈合瘺管樣本之間的值，在A組中，從第7天開始，成功治療的動物中BLI的趨勢逐漸升高。這一差異在第30天有顯著差異，分別為8.23×104(1.18～16.9×104)和1.74×104(0.156～6.88×104)p(s·cm2·sr)，分別為17.1%和5.54%(P=0.0393),見表2。

表1 A組大鼠(16只)隨訪期間BLI(熒光輻射強度)及干細胞存活比率變化

表2 A組大鼠隨訪期間愈合樣本(6只)與未愈合樣本(10只)間BLI(熒光輻射強度)及干細胞存活比率變化比較

3 討論

盡管目前進行了聯合手術和保守藥物聯合治療的方法，但克羅恩病(CD)的肛周瘺管仍然是一種嚴重影響患者生活質量的破壞性疾病。有幾項研究報道了局部治療MSCs的療效。然而，發表的臨床結果具有很高的可變性，主要是由非隨機試驗的小群體。因此，作者決定在實驗中驗證這種方法的可能性。

應用ADSCs導致愈合率要明顯高于安慰劑(38%vs6.3%,P=0.033)。在僅有的一項類似的實驗研究中證實了局部治療ADSCs的療效。它的主要目的不是治療瘺管病，而是減少腸經皮瘺和改良的無瘺道的簡單盲腸造瘺的區域。在我們的研究中，在干預組中有38%的動物被觀察到完全愈合。與臨床試驗相比，這一成功率較低。然而，大多數試驗都使用聯合治療報告結果。在局部應用MSCs之前，可先切除或切除瘺道，或最終縫合內部開口。最大的多中心隨機試驗的初步結果(212例乳糜瀉患者)報告了異基因ADSC管理與第24周的安慰劑相比對瘺愈合的顯著影響49.5%。所有患者均繼續服用藥物，并在治療前進行瘺道刮治術，這本身導致了安慰劑組34.3%的瘺管閉合 。我們的結果顯示了純細胞治療對瘺管愈合的真正影響。共使用了4×106個細胞(2mL懸浮)。在最初的人體試驗中也使用了類似的劑量[3]。在先前提到的經皮瘺大鼠的實驗研究中，使用相同數量的細胞。高劑量不會導致更好的效果，這在國外的基礎試驗中已經被證實描述[6]。 使用了周圍的腹股溝脂肪組織作為MSCs的來源。然而，一些已發表的人體試驗選擇了從骨髓中分離出來的細胞。骨髓源異基因細胞的優勢在于，當與年輕的健康捐贈者分離時，可能會有冷凍保存和更高的再生和免疫調節的可能性。另一方面，皮下脂肪組織是MSCs的一種容易且不易侵入的來源。事實上，ADSCs保留了它們的多線性發育可塑性，根據一些研究，與從骨髓中分離出來的細胞相比，它們在免疫表型上的異質性更小[13]。

由于光發射強度和活細胞數量的相關性，BLI技術提供了一種非侵入性的植入ADSCs體外監測的可能性。在我們的研究中，BLI的動力學顯示了在細胞質量在前2d損失最大，約下降了一半。隨后，還原率趨于減慢，14和30d后，可檢測的細胞分別占其初始量的21%和8.87%。在對大鼠骨盆底損傷治療的研究中也發現了類似的趨勢。在前7d之后，只有1/4的應用細胞在現場被檢測到。一個月后達到穩定的細胞量，在隨訪2個月后仍維持在3%。這種快速減少的細胞質量可能是由于在發炎的周圍組織中缺乏基質或免疫反應。

BLI信號只在應用區域中檢測到，而細胞沒有遷移到其他區域或器官。一個可能的原因可能是ADSCs被由炎癥的周圍空間組織釋放的趨化因子所吸引。在我們的研究中，干預組A組的BLI和未愈合的動物表現出在第一周內具有較大變異性的可存活細胞的可比性降低。然而，從第14天開始，當閉合和打開瘺管的數量穩定后，在已愈合的大鼠中，BLI的值更高。這一差異在第30天具有統計學意義。這一結果表明ADSCs分化為單個細胞株，并在愈合過程中融合，從而解釋了瘺管愈合與存在的相關性。在第14天的非顯著性差異也可以用少量的實驗對象來解釋(6個愈合的和10個未愈合的動物)。根據我們在接種后早期觀察到的快速細胞減少，可以通過重復的應用來獲得更高數量的可行的ADSCs。這項措施可以提高治療效果，這應該在臨床試驗中得到反映和評估。應用接種之間的最佳間隔時間似乎<7d。在相對較短的隨訪中，可能不會注意到最終的瘺管復發。這通常發生在克羅恩病(CD)患者的炎癥性腸活動[5]。考慮到我們模型中的瘺管是人工造成的，沒有慢性腸炎癥的背景，在最初愈合后，這種復發不太可能發生。關于術后并發癥及其他不良事件，30d的觀察期根據經典定義是可以被接受的。

綜上所述，在動物模型中，在瘺管周圍組織局部應用脂肪間充質干細胞后，瘺管閉合率明顯高于對照組。